实施量化分析
为获得一个两张图像间定量区别的印象，用双视图打开图像。
在散布图中查找感兴趣的斑点
为查找感兴趣的斑点，您可以在两张图像间比较他们表达水平的差异。在双视图的斑点菜单中，点击'Spots -> Show Scatter Plot'，打开两张图像的斑点图像展示。
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| 散布图 |
斑点的位置取决于它在每张图像上的标准化体积 : 在这个例子中，x坐标是他在Control_01中的定量，而z坐标是它在1min_01图像中的定量。因而，一个拥有在两张图像中不变体积的斑点将出现在这个图像的45度线上，而诱导的斑点将在左上角，减弱的斑点则会出现在右下角。现在我们点击一个散布图上或者最上或者最下的极值斑点，并继续观察双视图。选择的斑点形状将会在双视图中亮显强调出来，如果必要，视图将会卷动到选择的斑点。
通过表达特征来鉴定感兴趣的斑点
您可以在整个项目中全程查看一个斑点的表达特征。在双视图菜单中，点击'Rollups -> Expression Profiles'。
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| 整个项目中汇总显示表达特征斑点强度
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一个新窗口会弹出并保持位置在其父窗口之前(称为'Rollups'之一) 。确保选定斑点选择器，移动鼠标指针到一个特定的斑点。汇总将动态的在项目全程中显示此斑点的表达特征。其每一个长条的高度取决于斑点的相对体积(% Vol)，即在减去背景和标准化后的斑点强度。现在，移动鼠标指针到下一个斑点，并观察表达特征是如何改变的。
过滤出感兴趣的表达特征
选择'Window->Quantitation Table'切换到定量表，定量表窗口将在3个不同的视图上显示斑点数据。
- 'Single gel view'(单一凝胶)视图
显示斑点数据例如在单一凝胶图像上的相对体积，面积和斑点ID。斑点的量在% Vol列中定义，是减去背景，数量化和标准化后的结果。您可以点击窗口底部带有凝胶图像名称的标签，从而打开单一凝胶图像的表格。
- 'All gel images'(全部凝胶图像)视图
为项目中的全部图像显示斑点数据，表达特征并以列展示在表格中。表示相对容量的列以外，此表格还包括比率列，以颜色代码和数字的形式显示表达比率。所有的比率列都参照一个共同的的比率图像基数来计算，如果必要，可在表格属性中进行修改(选择 'Columns -> Table properties')。
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| 定量表 – 统计视图
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- 'Statistics'统计视图
显示相对体积，平均数和组内的相对方差，附带关于第一组的t-检验的测试结果。使用统计学视图您可以计算相对比率，如'mean of group 1min / mean of group control' (第一组的平均值对于对照组的平均值)。
定量表与其他的视图同步: 例如选择一个表达特征将在双视图或扩散图中选择斑点。
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| 过滤器对话框
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Delta2D提供了用于根据规则鉴别相关表达特征强有力的工具。我们现在选择特定斑点，他们的强度在两个样本组中，都比参照样本增加或减少一个至少为2的倍数。这个2的倍数是对于平行组的平均数而言的，也就是在'1min' 和'10min'组中的平均强度要至少双倍大于或小于参照组的平均强度。
请按照下列步骤，查看匹配规则的斑点。
- 切换到定量表，选择统计标签。
- 查看列的名字，可以在两列表头之间推拽使其变宽，也或者用鼠标简单的指向表头，稍等片刻即可看到显示本列名称的提示条。我们正在查找的列的名字是'Ratio mean % volume 1min / mean % volume control'。点击标记为'Filter'的列的顶部可打开相应的过滤器。
- 向字段'Show values from ... to ...'中插入过滤器边界(0.5和2)。或者您可以拖拽左边的在直方图下左边的滑动条。选项'Filter active'会被自动选上，另外选上'Negated'的选择框。直方图能突出显示比率值的分布。
- 按下OK以关闭对话框。现在定量表将只显示那些，主要包括扩大和缩小至少两倍的斑点的表达特征。
为表列'Ratio mean % volume 10min / mean % volume control'重复以上步骤2-4。再次打开双视图，显示两幅图像'control_01'和'1min_01'。
只有匹配规则的斑点才会在那里显示出来。
高级统计学分析
Delta2D应用了分析双向凝胶的高级多元统计学，包括:
- 表达档案的热图显示
- 多种聚类方法
- t-test (t-检验)偏差
- 偏差分析(ANOVA)
- 表达特征的模板匹配
Delta2D里的统计学分析基于TIGR MeV (Multiple Experiment Viewer)，且紧密结合在图像分析流程中。应用Delta2D 100%斑点匹配可以避免丢失数据，匹配的问题也实际上得到了解决。
大多数的统计学算法都推荐了最小适用的数据集合，而另外的一些方法甚至必须建立在这样的最小适用之上。本演示项目较小，导致分析结果并不可信赖。但是仍然可以用来去帮助理解Delta2D在统计分析中是如何运作的。
打开定量表(Window / Quantitation Table)并确信定量表已被选择。为融合图像隐藏其定量数据: 选择Column / Column Properties列属性, 并取消选定靠近融合图像的那个复选框。随后按下OK，将融合图像从当前分析中排除出来。
获得表达数据的一个高水平总览 - heat map(热图)
按下统计表左上的分析按钮，打开一个新的统计窗口，它包含了当前表达特征在热图中的显示。
按下统计表左上的分析按钮，打开一个新的统计窗口，它包含了当前表达特征在热图中的显示。
贯穿上部的图例说明展示了斑点强度的颜色编码。依据凝胶图像上的斑点标签来标记行。作为默认，数据在显示热图之前已经标准化。
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| 例项中的热图 |
发现表达特征中的模式
图像聚类是进行评估定性定量数据的有力的第一步。
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| HCL设置对话框 |
实施hierarchical clustering (分层聚类)应用数据来展示更多的结构: 按下工具条中的HCL按钮。采纳默认设置并按下OK按钮。分层聚类将把样本凝胶图像和表达特征分组，并展示在一个树形结构中。正如您所看到的，平行实验被分类到了一起，表明他们有较高的相似性。
找到不同的表达蛋白: 统计学测试
Delta2D提供了控制结果组中假阳性(FDR)比例的方法。总之，在误拣出率方面的优化，允许人们打破了统计学上发现感兴趣的有效蛋白其需要，和伴随于假阳性而来的附加开销之间的平衡。
在t-检验 选项对话框中，选择"p-values based on permutations"和"Stepdown Westfall and Young methods"，以及"Stepdown Westfall and Young methods"。使用"number of false positive genes should not exceed"，为结果集中允许存在的假阳性斑点的选择数目限制。或者您可以使用其他的单选按钮和文本框，选择假阳性斑点比例的限制。
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| t-检验参数. |
手册中还有许多其他关于Delta2D中统计学分析知识的介绍。
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