应用智能向量的变形技术
背景知识: 为什么变形技术对于双向凝胶电泳非常重要？
通常，同一蛋白质斑点在不同的凝胶上位置会略微不同。这些位置的不同正是导致传统双向凝胶电泳分析软件效率不足的原因。
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| 网格下的凝胶图像 | 同一凝胶图像经过变形后 |
如果您使用过传统的双向凝胶电泳分析软件包，您可能已经经历过并熟悉，那些因软件"自动"识别而来的，如斑点匹配和边界确定等一系列冗长枯燥的编辑工作。
Delta2D的图像变形技术在斑点识别和定量分析之前，应用图像处理算法(Warping)，消除了这些双向电泳图像间跑焦的不同。结果趋向于获得完美的凝胶: 变形后，对应的蛋白斑点拥有完全相同的位置。
DECODON公司在双向凝胶分析中率先应用图像变形技术，并于2000年发布Delta2D软件的1.0版本。
荧光差异双向电泳和其他复杂方法允许在同一张凝胶上同时分离多种组分。从而缓和区分斑点位置的问题。然而，一旦实验中包括了多个凝胶，凝胶分析软件将不得不处理不同迁移位置而来的问题。
这里你看到一张由两张凝胶合成的复合图像。一张染成橙色，一张为蓝色。在这个双通道未变形的图像中，较难找到对应的斑点和比较它们的表达模式。
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| 两张凝胶图像，重叠为一个双通道图像，未变形 |
两张凝胶图像，变形后重叠为一个双通道图像。可以清晰的看到表达水平的区别。
变形技术允许Delta2D为整个图像集指派对应的图像位置，如此，实现100%斑点的匹配和图像的融合。 |
变形后，双通道图像给出有价值的细节，用于量化比较斑点模式。凝胶A(gel A)中蓝色斑点较强，而橙色斑点在凝胶B(gel B)中较强。暗色斑点暗示这些斑点在两张凝胶中拥有大致相同的强度。
但是变形方法的长处要远远大于制作双通道图像。应用图像变形的效果是如同您可以取得完美的凝胶图像: 允许全部的蛋白准确的迁移到相同的位点。并且由于Delta2D知道点对点像素的对应到图像的关系，因而，一系列Delta2D其它的核心技术都可以被采用进来。
- 100%斑点匹配
提升表达特征分析水平到更高的统计学确信度。
- 图像融合
使您可以联合多个图像，例如生成平均图像。
- 蛋白组图
使用集合融合图像，如存储蛋白鉴定信息。
- 颜色编码
考虑色斑颜色的表达特征分析，结合融合图像和100%斑点匹配信息，可以用来纵览拥有相似特征的一组蛋白分析。
Delta2D的SmartVectorTM (智能向量)技术， 基于凝胶图像上的区域相似性，提供了自动的变形校正方案。
定义一个变形策略
对于在Delta2D里的整个实验来说，变形技术基于凝胶之间的配对变形。您不必为项目中的每一个可能的凝胶图像对生成匹配向量：只要给定一个凝胶A和B之间的变形，以及凝胶B和C之间的变形。Delta2D将会自动的建立隐含的A和C之间的变形关系。
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| 隐含的凝胶图像变形 |
'Warping Strategy'(变形策略)包含配对变形的定义，Delta2D将用此来创建整体的变形。它可以是平面的，也可以是分层的。
在项目管理器菜单中选择'Project -> Warp Strategy' (项目->变形策略)，选择组变形策略，定义组内和组间自动适应变形，随后按OK以应用选择的策略。
应用组变形策略，您可以使用自动变形模式，在每个平行的组中变形凝胶。变形 'con-trol'(参照)组的第一个凝胶以连接平行重复组(control_01)到'1min'和'10min'组的第一个凝胶，然后再一次使用自动变形模式。
组变形策略适应大多数含有平行测定组的项目。建立策略的主要准则是直接联系相似的凝胶，以保证所有可能的凝胶对，可以经少量直接的变形而校正，更多信息请参照 'Defining a Warp Strategy for the Complete Project' （为整体项目确定一个变形策略）。
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| 变形策略管理器 |
您也可以使用内容菜单的项目管理器为每个单个小格定义变形模式。然而，使用变形策略对话框， 显然更容易快捷且不易出错。
自动变形采用SmartVectorsTM 技术，使用连接相关斑点的一组匹配向量来传递结果。经常的检查生成的双通道图像，如果必要请按照文档稍后描述的方法，迭代的逐步提高变形效果。
策略管理器优先权高于先前的手工指定的变形方法。所以请在组织一个新项目后应用，并特别注意以后的再次应用。已经存在的匹配向量将不会被影响。
在这个项目管理器窗口中，您现在看到代表凝胶图像的小格显示已经被改变了。
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| 建立变形策略。当鼠标指针移动到小格或图片上的时候，可注意到弹出的提示信息。
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如以上所述，变形策略使用自动的变形在同一个组内连接图像，且连接每一个组内的第一个图像到control_01。项目管理器反应为：一个黄色的圆圈表示在那个行列中的图像应直接变形。其他所有可能的凝胶图像对，可以通过结合一个或多个变形的方案进行变形。
作为一个指导方针，您可以认为黄色的圆圈指示您在那里你可以进行变形步骤。通过为每一个图像对创建匹配向量，我们使Delta2D可以对整个项目进行变形校正。
当使用自动变形的时候， 您可以令Delta2D自动执行这些变形工作。 选择'Window -> Job Manager'， 然后点击'Run' 按钮，工作管理器将会监控和执行自动变形工作。
为DIGE和其他复合项目创建变形策略
Delta2D 为DIGE和其他使用一个内标的复合实验提供特殊的变形策略。在同一个凝胶中，我们不必进行任何变形，因为样本是同步迁移的。而在多个凝胶间的变形，我们则使用内标图像，因为他们显示了相同的内标样本，通过此可以让其凝胶非常容易的进行变形。
在您开始前，请确信您已经在项目属性中选择了'use internal standard'(使用内标), 并且指定了凝胶和内标图像。
在项目管理器菜单中选择'Project -> Warp Strategy'，选择'In-Gel Standard Warping Strategy'。
凝胶内变形的模式应该被设为一致(Identical)，凝胶之间变形模式应该被设为严格(Exact)。然后按'OK'来应用选择的策略。
变形模式'Identical'的意思是，Delta2D软件将视图像为as-is, 而不作任何变形。如此适合来自同一凝胶上的图像。当然，如果您想应用Delta2D变形，您也可以改变这个设置(例如，当不同图像间有轻微的位移).
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| 变形管理器 – 凝胶内标准变形策略 |
SmartVectorsTM: 自动找到匹配向量
这一步的目的，是生成能使一张图像上的斑点，能对齐其它图像上相对应的斑点的变形。在项目管理器中，您可以看到代表每一个直接变形的黄色的圆圈。变形是建立在被称为匹配向量的基础上的。Delta2D的SmartVectorsTM Technology (智能向量技术)可协助您快捷信赖的生成这些匹配向量。
在这个项目管理器中您看到项目中所有的图片以表格形式排列。为了在双视图中打开一个凝胶图像对，鼠标点在一个图像的行(如'control_01') 和另一个图像的列(如'control_02') 交叉的单元格，然后按下'view'按钮。然后会打开一个新的窗口（双视图窗口），显示两张图像的组合 (如'control_01'标记为蓝色而'control_02'为橙色).。从而您可以一眼就看到斑点位置的区别: 黑色或灰色表示两张图像上的定量大致相同。橙色斑点表示在第二张图上占优，而蓝色斑点则在定量上弱于第一张图。颜色趋向一端的越明显，说明其表达的差异就越大。
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| 两张凝胶图像的双通道图 |
如果您在按本指南，分析您的第一个DIGE实验，请您在双视图中打开来自两个不同凝胶的内标图像。
当然您可以任何时候浏览双通道图像，放大缩小或者仅观察单个的图像。您也可以在'Images'(图像)菜单中选择'Histograms...'( ) aus dem Menü 'Images' verändert werden.
来更正图像的展示, 使用滑动条调节设置，点击工具条中的平衡图像按钮Equalize Image Button ( )
，从而能确保两张图像都平衡了。这些修改只会影响凝胶可视化，而定量则是来自于原始图像。请您还要检查凝胶图像的背景是否已用工具条中的'show/hide background'( )键隐藏了。这些调节将有助于更好的观察斑点位置的不同。
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| 直方图设置对话框 |
按下'找到匹配向量'('Find Match Vectors')。Delta2D将使用SmartVectorsTM技术来找到一套匹配向量(匹配图)，并且切换变形模式到精确。匹配向量因为是自动建立的，故显示为虚线。
Delta2D区别手工设置的匹配向量(显示为实线)于自动建立的匹配向量(虚线)。通过'approving'(认可)一个您选定的匹配向量，然后应用其来指导发现更多的匹配向量。
现在按下变形按钮，Delta2D将参照匹配图使用精确exact变形模式，来变形橙色的图像。在生成的变形视图中，通常非常容易看到所有的参照斑点是否都被对齐了。未充分对齐的区域显示在图像中的为相似的蓝色和橙色的斑点模式。Delta2D将仅在确信的对应区域中建立匹配向量。在任何时候想要参照原始图像，查看或检查匹配向量，您可以(按unwarp )来反变形图像。
如果有区域还未能进行正确的变形，您可以再次使用'Find Match Vectors'按钮。Delta2D的SmartVectorsTM技术将使用这些已经存在的向量来指导去发现新的向量。
按下'Find Match Vectors' 按钮，Delta2D将会询问您如何处理在先前步骤中自动建立的向量: 您可以决定使用它们作为新的一轮SmartVectorsTM的基础。
一旦您已在图像对中认可任何的匹配向量，项目管理器中的符号将从黄色转换成绿色，表示您已经使用过了这些匹配向量。当您结束一个凝胶对的时候，审核一下所有的匹配向量是一个很实用的习惯。(使用Matches -> Select Non-Approved, 而后Matches -> Approve Selected)。
手动创建，删除和改变匹配向量
使用匹配向量工作，您需要首先选择匹配向量。在双显示窗口的左边，点击垂直工具面板中最上面的按钮。
有时您想要改正或提高Delta2D自动找到的匹配向量。常规的途径是处理整个的图像区域(不是单个斑点)。如果区域中一个或多个匹配向量不正确，您可以直接删除这个区域中全部的匹配向量，然后再次按下'Find Match Vectors'来找到更好的匹配向量; 周围区域的向量可以用来指导这个过程。
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| 变形后的双显示 |
当然，如果需要，您可以手动设置和改变所有的匹配向量。
- 选择一个单匹配向量
通过点击它您可以选择一个单匹配向量。选择的匹配向量显示为高亮。
- 选择一个区域中的匹配向量
鼠标拖拽一个方形(保持按下鼠标左键)，所有的方形范围内的向量会被选中。
- 删除匹配向量
右键点击一个匹配向量并在菜单中选择'Delete Selected'，将删除所有选择的匹配向量。
- 设置新的匹配向量
点击橙色图中的色斑，随后是蓝色图中对应的色斑。作为默认方法，当你点击的时候按住CTRL键，可以自动的将匹配向量的末端对齐在斑点的中心上。
- 改变匹配向量
为改变匹配向量，可以拖拽匹配向量的一端。拖拽的同时按住CTRL键可以切断斑点的对齐。
您可以通过在编辑菜单上选择'Undo'来撤销匹配向量操作。
点击变形按键以应用您新的匹配向量。您可以反复的添加或删减匹配向量，直到结果满意为止。
校验结果
由于整体实验的分析质量取决于变形过程的准确程度，所以在这一步精确和仔细的操作，是至关重要的。为了控制此变形步骤的准确程度，请核实如下列出的项目：
- 在项目管理器中，您应该看到所有的单元小格标记为绿色圆圈或不包含任何圆圈。
- 为每一对为绿色圆圈的单元小格，打开双视图来检查变形的双通道图像。
即使您已设置变形模式为自动，仍然需要在双视图中修改变形的结果，以便于检查是否您已经对结果满意或者此修正是否必要。
演示数据集包括已准备好的匹配图。为了节约时间，只是为双显示中的一对凝胶图像导入其对应的匹配图。在菜单中选择Matches->Import(导入)。如果蓝色的匹配向量末端指向橙色的斑点，或者反之匹配向量的方向错误，您需要选择'Matches > Invert'(反转)来改变它们。
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