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Quantitative Auswertung der Daten

Für eine qualitative Analyse eines Gelbild-Paares anhand der Farben im Dual Channel Bild konsultieren Sie bitte den Abschnitt 'Warum ist Warping für die Auswertung von 2D Gelbildern so wichtig?'.

Interessante Spots mit einem Scatter Plot finden

Vergleich der Expressionsniveaus von Spots auf zwei einzelnen Bildern.
Wählen Sie bitte in der Dual View 'Spots' -> 'Show Scatter Plot', um eine graphische Darstellung der Spotquantitäten auf beiden Bildern zu öffnen.

Scatterplot

Die Position eines Spots wird anhand seines normalisierten Volumens auf jedem Bild bestimmt: in diesem Beispiel entspricht die x-Position der Quantität auf 'control_01' und die y-Position der Quantität auf '1min_01'. Spots mit gleichem Volumen auf beiden Bildern erscheinen somit auf der 45-Grad-Linie des Diagramms. Induzierte Spots sind in der linken oberen Hälfte, reprimierte Spots in der rechten unteren Hälfte zu finden. Klicken Sie auf einen der Spots in der oberen oder unteren Hälfte, um ihn in allen anderen Fenstern von Delta2D zu selektieren. Sie können sich den selektierten Spot nun in der Dual View des Paares, in der multiplen Geldarstellung bzw. für quantitative Informationen in der Quantitation Table anschauen.

Interessante Spots über deren Expressionsprofile finden

Das Expressionsprofil jedes Spots kann über ein Rollup in der Dual View angezeigt werden: Wählen Sie in der Dual View 'Rollups' -> 'Expression Profiles', um ein neues kleines Fenster vor dem Dual View Fenster zu öffnen: eines der sog. 'Rollups'.

Wählen Sie bitte das Spot Selection Tool aus dem linken Toolpanel aus und fahren Sie dann einfach mit dem Mauszeiger über einen bestimmten Spot.

Das Expression Profiles Rollup zeigt den Verlauf der Spotintensität über das gesamte Projekt

Aktivieren Sie das 'Spot Selection Tool' und bewegen Sie den Mauszeiger auf einen bestimmten Spot. Das Rollup zeigt nun dynamisch das Expressionsprofil dieses Spots. Die Höhe jedes Balkens wird durch das relative Scatter Plot Volumen (% Vol) des Spots - Spotintensität nach Hintergrundabzug und Normalisierung - auf dem jeweiligen Gelbild bestimmt. Bewegen Sie nun den Mauszeiger zum nächsten Spot, und dessen Expressionsprofil erscheint im Rollup.

Filtern nach interessanten Expressionsprofilen in der Tabelle

Öffnen Sie die Quantitation Table über das 'Window' Menü. Das Tabellenfenster zeigt drei verschiedene Sichten auf die quantitativen Spotdaten:

• Spotdaten eines einzelnen Gelbildes
  Zeigt relatives Volumen (%V), Area, und ID. '%Vol' ist das Ergebnis nach Hintergrundabzug, Quantifizierung und Normalisierung. Sie können die Spotdaten für jedes Gelbild durch Linksklick auf den mit dem entsprechenden Gelbildnamen beschrifteten Tab abrufen.
• Spotdaten aller Gelbilder 'All gel images'
  Zeigt Spotdaten für alle Gelbilder des Projektes - mit einem Expressionsprofil je Spot in jeder Zeile. Zusätzlich zu '%Vol' Spalten enthält diese Tabelle u. a. 'Ratio' Spalten, welche die Expressionsverhältnisse als Farbcode sowie numerisch zeigen. Alle 'Ratio' Werte beziehen sich auf denselben 'Ratio Master', der unter 'Columns' -> 'Table properties' geändert werden kann. Hier können auch zusätzliche Spalten ausgewählt werden.

Quantitation Table: 'Statistics View'

• Statistische Aufbereitung in der 'Statistics' View
  Zeigt neben den relativen Volumina der Spots Mittelwert, Median und relative Standardabweichung der jeweiligen Gruppe sowie den t-Test Wert bezogen auf die erste Gruppe. Die Ratio-Werte werden als Quotient aus dem jeweiligen Gruppen-Mittelwert und dem Mittelwert der ersten Gruppe berechnet.

Die Quantitation Table wird mit allen anderen Sichten in Delta2D synchronisiert: Auswählen eines Expressionsprofils (d.h. einer Zeile) hier selektiert den Spot in allen anderen Fenstern, z.B. in der Dual View.

Filter Dialog

Delta2D bietet viele Werkzeuge zum Finden von für Sie besonders interessanten Expressionsprofilen: Sie können beispielsweise nach Spots suchen, deren Intensitäten in beiden behandelten Gruppen 2-fach stärker oder schwächer im Vergleich zur Kontrollgruppe exprimiert sind. Dieser Faktor '2' soll auf die Mittelwerte der Replikatgruppen zutreffen, d.h. der Mittelwert der Gruppen '1min' und '10min' sollte mindestens 2-mal höher oder niedriger als der Mittelwert der Gruppe 'control' sein.

Um nur die Spots zu sehen, die diesem Kriterium entsprechen, führen Sie bitte folgende Schritte aus:

1. Öffnen Sie die Quantitation Table und wählen Sie den 'Statistics' Tab aus.
2. Wir suchen die Spalte 'Ratio mean % volume 1min / mean % volume control'. Um den Spaltennamen zu sehen, ziehen Sie die Linie zwischen zwei Spalten oder fahren Sie mit der Maus über den Spaltenkopf und warten Sie bis der Name erscheint. Klicken Sie auf den 'Filter' Button der Spalte, um den entsprechenden Filterdialog zu öffnen.
3. Geben Sie die Filtergrenzen '0.5' und '2' in die Felder 'Show values from ... to ...' ein. (Alternativ können Sie auch die Schieberegler unter dem Histogramm verwenden.) Aktivieren Sie 'Negated' ('Filter active' wird automatisch aktiviert, sobald Sie mit OK bestätigen). Im Histogramm sehen Sie die Verteilung der Ratio Werte.
4. Bestätigen Sie mit OK, um die Einstellungen zu übernehmen und in der Tabelle nur noch die Spots zu sehen, die dem Kriterium entsprechen.

Wiederholen Sie 2. - 4. für die Spalte 'Ratio mean % volume 10min / mean % volume control'.
Öffnen Sie nun die Dual View mit 'control_01' und '1min_01': Nur Spots, die unseren Kriterien entsprechen, werden dort noch mit Spotumriss gezeigt.

Erweiterte Statistische Auswertungen

Delta2D bietet für die statistische Auswertung Methoden des Clusterings, der multivariaten Statistik und zur Dimensionsreduktion großer Datensätze. Dazu gehören unter anderem:

• Heatmaps zur Visualiserung der Expressionsprofile von Spots,
• Methoden für das Clustering von Spots, Gelbildern etc.,
• Diverse Subtypen des t-Tests,
• Einfache und bifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA),
• Pavlides Template Matching (PTM),
• Hauptkomponentenanalyse (PCA - Principal Component Analysis).

Die beschriebenen Verfahren basieren auf Algorithmen zur DNA-Array-Analytik und wurden im TIGR MeV (Multiple Experiment Viewer) bereits etabliert. Da Delta2D's 100%iges Spotmatching - äquivalent zu DNA Arrays - für vollständige Expressionsprofile sorgt, konnten wir diese Verfahren nun auch für die Analyse von 2D Gelen verfügbar machen.

Die meisten statistischen Verfahren sollten erst ab mindestens 4 Replikaten verwendet werden. Einige andere sind sogar erst ab 10 Replikaten sinnvoll anwendbar. Zwar ist unser Beispielprojekt mit zwei Replikaten je Gruppe zu klein für eine sinnvolle Analyse, veranschaulicht aber dennoch den Nutzen einzelner Methoden.

Für eine Beispielanalyse gehen wir von der Delta2D 'Statistics' Tabelle aus. Verstecken Sie zunächst die Daten des Fusionsbildes, da diese sonst wie Daten einer normalen Probe behandelt würden: Dazu öffnen Sie 'Column' -> 'Table Properties' und deaktivieren Sie die Checkbox neben dem Fusionsbild. Bestätigen Sie mit OK, um das Fusionsbild von der Auswertung auszuschließen.

Heatmaps erzeugen einen visuellen Überblick über die Expressionsprofile

Per 'Analyze' Button (oben links in der 'Statistics' Tabelle) öffnen Sie das TMEV Auswertungsfenster. Zunächst wird eine sog. Heatmap erzeugt. Jede Zeile zeigt ein Spotprofil, jede Spalte ein Gelbild. Spotlabels - soweit vorhanden - werden rechts gezeigt. Beim Erzeugen der Heatmap wurden die Daten zur besseren Vergleichbarkeit normalisiert und standardisiert, und die letzte Sortierung der 'Statistics'-Tabelle wurde übernommen.

Die Legende am oberen Rand erklärt den verwendeten Farbcode für die Spotintensitäten (links: unterdurchschnittliche Expression, Mitte: durchschnittliche Expression, rechts: überdurchschnittliche Expression).

Heatmap für das Beispielprojekt.

Klassifizierung der Expressionsdaten in Regulationsgruppen

Zur Klassifizierung ähnlicher Expressionsprofile können Sie zunächst 'hierarchisch Clustern'. Klicken Sie dazu auf den 'HCL' Button in der Werkzeugleiste. Benutzen Sie 'Gene Tree' zum Auffinden ähnlich exprimierter Gene, 'Euclidian Distance' als Ähnlichkeitsmaß und 'Complete Linkage' zur Clusterkonstruktion. Bestätigen Sie die Einstellungen mit OK. Die Expressionsprofile (Spots) werden entsprechend ihrer Ähnlichkeit gruppiert.

Dialogbox für die Einstellungen für HCL.

Der Baum-Graph hebt Ähnlichkeiten zwischen Expressionsprofilen hervor. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf einen Subbaum und alle Proteinspots derselben Ähnlichkeitsklasse bzw. Regulationsgruppe werden selektiert. Da auch hier die Selektion völlig synchron verläuft, können Sie im Dual Channel Bild oder in der Quantitation Table sofort alle ähnlich exprimierten Spots anschauen.

Hierarchical Clustering über die Expressionsprofile.

Möchten Sie die Experimentstruktur bestimmen, so clustern Sie bitte ebenfalls per HCL, wählen aber bitte den Sample Tree (Gelbilder) aus. Replikatbilder sollten hier beispielsweise aufgrund ihrer Ähnlichkeit im gleichen Cluster (Subbaum) auftreten.

Modellprofile mit Template Matching finden

Beim Template Matching können Sie Expressionsprofile mit Ähnlichkeit zu einem Modellprofil finden.

Dazu aktivieren Sie die Schaltfläche PTM im TMEV-Fenster. Im unteren Teil der erscheinenden Dialog-Box sehen Sie eine Anzahl von Schiebereglern, mit denen Sie den ungefähren Verlauf des für Sie interessanten Modellprofiles festlegen können. Sobald das definierte Profil Ihrem Wunschmodell entspricht, bestätigen Sie mit OK.

Zu einem Template passende Expressionsprofile

TMEV zeigt über der erscheinenden Heatmap das definierte Template und darunter alle zu Ihrem Wunschprofil ähnlichen Expressionsprofile.

Signifikant differentiell exprimierte Proteinspots finden: Statistische Tests

Beim t-Test bietet Delta2D diverse Methoden zum Überwachen des Anteils falsch-positiver - irrtümlicherweise als signifikant differentiell exprimiert gefundener - Spots an. Die sog. 'False Discovery Control' ermöglicht es, die Balance zwischen der Notwendigkeit, differentiell exprimierte Spots zu finden, und den Kosten, die durch das Weiterverfolgen falsch-positiver Proteine entstehen, zu halten.

Wählen Sie bitte im t-Test Dialog 'p-values based on permutations' und 'Stepdown Westfall and Young methods' aus. Geben sie zudem die Grenze für maximal gefundene falsch-positive Spots unter 'The number of false positive genes should not exceed' an. Selbstverständlich können Sie diesen Wert darunter auch als Prozentsatz ('The proportion of false positive genes should not exceed') angeben.

t-Test Parameter.

Delta2D stellt mit TMEV viele weitere statistische Auswertungsmöglichkeiten zur Verfügung. Bitte konsultieren Sie hierzu das Delta2D- oder das TMEV-Manual.