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Vollständige Expressionsprofile
und 100%iges Spotmatching

Delta2D's 100%iges Spotmatching basiert auf fortgeschrittenen Bildverarbeitungsmethoden und wurde im Jahr 2003 von DECODON eingeführt. Eine allgemeine Darstellung dieses Ansatzes finden Sie unter "100% Spot Matching".
100%iges Spotmatching garantiert vollständige Expressionsprofile für jedes Protein. Dies führt zu signifikant verbesserter statistischer Verlässlichkeit der quantitativen Daten, so dass Sie beispielsweise mehr Biomarker-Kandidaten in einem Experiment finden können. Alternative Ansätze in der 2D-Gel-Analyse (z.B. separate Spoterkennung für jedes Gelbild) führen häufig zu falschen Matchings und zu fehlenden Werten in den Expressionsprofilen.

Ausgehend von einem Projekt mit vollständigem und qualitativ hochwertigen Warpings, besteht die quantitative Analyse in Delta2D aus drei Schritten:

1. Mit der Bildfusion erstellen Sie ein Bild, welches alle Spots des Projektes enthält.
2. Durch die Spotdetektion auf dem Fusionsbild erzeugen Sie eine einheitliche Spotmaske mit allen Spots des Gesamtprojektes.
3. Mit dem Transfer der Spotmaske auf alle Originalbilder ermöglichen Sie die anschließende Quantifizierung sämtlicher gefundener Spots auf allen Bidlern.

Ein Fusionsbild erzeugen

Das Fusionsbild (Fusionstyp 'Union') fasst alle Spots des Experimentes zusammen und dient als Basis für die einheitliche Spotdetektion und das vollständige Spot-Matching. Das Ergebnis ist ein artifizielles Gelbild mit realistischen Spotformen, welches die typischen Charakteristiken der Originalbilder vereint.

Die Bildfusion nutzt die Informationen aller für das Warping gesetzten Vektoren und kombiniert die Gelbilder pixelgenau zu einem neuen Bild.

Es gibt viele interessante Anwendungsmöglichkeiten von Fusionsbildern. Sie können Fusionsbilder beispielsweise als 'Proteomkarten' mit allen gesammelten Spotannotationen verwenden. Ferner können Sie auf Fusionsbildern eine Vielzahl von Auswertungsergebnissen visualisieren. Mit dem Fusionstyp 'average' kompensieren Sie experimentelle Schwankungen, indem mehrere Replikate zu einem Durchschnittsbild kombiniert werden. Große Anzahlen von Gelbildern können Sie so zu einem repräsentativen Bild zusammenfassen.

Lassen Sie uns nun ein Fusionsbild für unser Projekt erzeugen: Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das erste Bild ('control_01') im Project Manager und wählen Sie 'Fuse all Images' aus dem Kontextmenü. Ein neuer Dialog zur Einstellung der Fusionsparameter wird geöffnet. Belassen Sie 'control_01' als 'Master Gel Image' und wählen Sie 'Union' als 'Fusion Type' für die Erstellung einer Proteomkarte. Ändern Sie die anderen Einstellungen nicht. Für den Start der Bildfusion klicken Sie auf 'Fuse'. Nach der Fertigstellung erscheint das Fusionsbild in einer neuen Gruppe namens 'Fused Images'.
Öffnen Sie das Fusionsbild in einer Dual View, indem Sie im Project Manager auf die Zelle direkt unter dem Fusionsbild doppelklicken. Die Dual View zeigt Ihnen nun das Fusionsbild zusammen mit 'control_01'. Im Moment können wir 'control_01' ignorieren und uns auf das Fusionsbild konzentrieren. Daher klicken Sie bitte unten im Fenster auf das Tab mit dem Namen des Fusionsbildes.

Das Fusionsbild sieht wie ein echtes Gelbild aus. Dies wird durch die Kombination der Pixel aller Bilder mit einer gewichteten Durchschnittsfunktion erreicht. Noch wichtiger ist, dass die 'Union' Fusion als eine Proteomkarte des Projektes alle Spots beinhaltet - auch solche, die nur auf einem oder zwei Bildern auftreten.

Für DIGE Projekte können Sie die Bilder mit dem Internen Standard vom Fusionieren ausschließen (i. d. R. die Cy2 Bilder), da diese keine zusätzlichen Informationen im Vergleich zu den Einzel-Proben-Bildern enthalten.

Detektion der Spots auf dem Fusionsbild

Lassen Sie die Dual View geöffnet und bleiben Sie auf der Einzelansicht der Fusion. Wählen Sie 'Spots' -> 'Detect Spots on Fused Image', um die Spotdetektion zu starten. Ein neuer Dialog zur Eingabe der Detektionsparameter wird geöffnet. Da die vorgeschlagenen Werte in den meisten Fällen die besten Ergebnisse liefern, bestätigen Sie diese bitte mit OK.

Die vorgeschlagenen Parameter werden vom aktuellen Bild abgeleitet und führen zu einer sehr sensitiven Spotdetektion. Das Herausfiltern falsch-positiver Spots erfolgt später deutlich schneller als das manuelle Hinzufügen nicht detektierter Spots.

Editieren von Spots auf dem Fusionsbild

Sie können die Ergebnisse von Delta2D's automatischer Spotdetektion durch das Spotediting optimieren. Dafür gibt es drei Basisoperationen: Neue Spots hinzufügen, Spots teilen und Spots zusammenfassen. In jedem Fall wird Delta2D die Spotumrisse automatisch berechnen. Dieser Ansatz für die Spoteditierung sichert - so weit wie nur möglich - eine benutzerunabhängige Reproduzierbarkeit und bewahrt gleichzeitig die Möglichkeit der Anpassung der Spotdetektion.

Für das Editieren von Spots müssen Sie zunächst das Spot Editing Tool aktivieren: Klicken Sie auf den dritten Button im linken senkrechten Tool Panel der Dual View.

Neue Spots auf dem Fusionsbild hinzufügen

Um neue Spots hinzuzufügen, klicken Sie auf das Spotzentrum des zu detektierenden Spots. Ein neuer Marker ("+" Symbol) wird erzeugt und der neue Spotumriss berechnet.

Bildregion vor und nach dem manuellen Hinzufügen eines Spots

Spots vereinen

Benachbarte Spots können Sie mit dem 'Linien-Marker' fusionieren. Um zwei oder mehrere Spots zu einem Spot zusammenzufassen, verbinden Sie deren Spotzentren bei gedrückter linker Maustaste miteinander. Der entstandene Linienmarker dient als Basis für die Berechnung eines neuen Spotumrisses, der alle Spots umfasst, deren Spotzentren durch den Marker verbunden wurden.

Beispiele für vereinigte Spots.

Spots trennen

Manchmal detektiert Delta2D nur einen Spot, wo Sie zwei oder mehr Spot detektiert haben möchten. Klicken Sie einmal auf das Spotzentrum des Spots, der nicht detektiert wurde. Ein Marker erscheint und Delta2D berechnet den neuen Spotumriss. Dieser kann - in Abhängigkeit von der Position des Markers - variieren.

Spotgruppen, die fälschlicherweise nur als ein Spot detektiert, dann aber durch Marker getrennt wurde.

Verschieben und Löschen von Spot-Markern

Spot-Marker können durch Ziehen mit der linken Maustaste verschoben werden. Für das Löschen von Spot-Markern klicken Sie einfach mit der rechten Maustaste darauf. Das Verschieben und Löschen der Marker verändert die Spotrumrisse, z.T. auch der benachbarten Spots, da diese nach beiden Aktionen neu berechnet werden.

Spots entfernen

Um Spots zu entfernen, aktivieren Sie bitte das 'Spot Selection Tool'. Klicken Sie nun mit der rechten Maustaste auf den jeweiligen Spot und wählen Sie 'Cancel'. Um eine ganze Region falsch-positiver Spots zu entfernen - beispielsweise an den Gelrändern - ziehen Sie mit der linken Maustaste ein Rechteck um diese Spots und canceln Sie diese durch Rechtsklick und 'Cancel Selected'. Über 'Spots'->'Show Cancelled Spots' können Sie entfernte Spots anzeigen lassen (gestrichelter Spotumriss) und/oder wieder hinzufügen (Rechtsklick und 'Cancel' anklicken).

Filtern nach falsch-positiven Spots

Im Regelfall liefert Delta2D sehr gut detektierte Spotmuster. Durch Verunreinigungen, Fingerabdrücke, Blasen etc. kann es jedoch zur Detektion 'falsch-positiver' Spots kommen. Diese Artefakte haben in der 3D Ansicht nicht die typische Spotform und sind häufig sehr schwach.
Werden zu viele schwache Spots detektiert, können Sie den 'Sensitivity' Parameter im Spotdetektionsdialog herabsetzen und damit neu detektieren. Delta2D berechnet jedoch auch einen 'spot quality'-Parameter für jeden detektierten Spot. Dieser Wert gibt an, wie sehr ein Spot dem 'idealen' 3D Gauss-Modell entspricht (je höher der Wert, desto 'idealer' - maximal '1'). Mit Hilfe dieses Wertes können Sie 'falsche' Spots sehr schnell herausfiltern:

• Öffnen Sie dazu die 'Quantitation Table' über das 'Window' Menü.
• Klicken Sie unten in der Tabelle auf das Tab für das Fusionsbild.
• Suchen Sie die 'spot quality' Spalte und klicken Sie auf deren 'Filter' Button.
• Im Filterdialog können Sie nun die Schieberegler verwenden, um die Filtergrenzen einzustellen. (0.2 ist häufig ein guter Wert)
• Klicken Sie auf den OK Button, um den Effekt des Filters zu sehen und den Dialog zu schließen.
• Schauen Sie parallel in der Dual View nach, ob aufgrund der gewählten Filterwerte nicht etwa 'gute' Spots herausgefiltert wurden und justieren Sie ggf. den Filter nach.

Wir empfehlen den Filter so einzustellen, dass Sie nur die Spots sehen, die Sie entfernen möchten (z.B. 'spot quality' < 0.2). Wählen Sie 'Edit' -> 'Select all' und dann 'Cancel' -> 'Cancel Selected Spots', um die Spots zu entfernen. Nun können Sie den Filter wieder deaktivieren: Rechts-Klick auf den Filter und 'Filter active' durch Linksklick deaktivieren. Alle falsch-positiven Spots sind jetzt gelöscht.

Sie haben nun die Spots auf dem Fusionsbild detektiert und ggf. die automatische Spotdetektion bearbeitet und nötigenfalls auch korrigiert. Da die Union Fusion alle Spots aller Bilder des Projektes enthält, kann das jetzt vorliegende einheitliche Spotumrissmuster auf das gesamte Projekt angewendet werden.

Spotumrisse transferieren

Der nächste Schritt auf dem Weg zur quantitativen Analyse ist der Transfer der Spotumrisse, d.h. der Spotmaske vom Fusionsbild auf alle anderen Gelbilder. Dort werden alle Spots innerhalb der transferierten Spotgrenzen automatisch quantifiziert.

Für den Spottransfer klicken Sie im Project Manager mit der rechten Maustaste auf das Fusionsbild und wählen aus dem Kontextmenü 'Transfer Spots to Gel Image' -> 'All'. Ein Fortschrittsbalken zeigt an, dass die Umrisse nun Bild für Bild übertragen und die Spots - auf den Originalbildern - quantifiziert werden. Da Sie die Detektion auf einem Union Fusion Bild vollzogen haben und alle Spotumrisse von dort übertragen wurden, erhalten Sie nun für jeden Spot ein vollständiges Matching und damit auch ein vollständiges Expressionsprofil.

Spotumrisse nach dem Transfer: Für die multiple Geldarstellung nutzen Sie 'Window' -> 'Gel Image Regions'. Sie sehen, dass jeder Spot auf jedem Gelbild genau einen Match-Partner hat.

Sie können die Spotumrisse durch Delta2D an die tatsächliche Größe des jeweiligen Spots auf dem Zielbild anpassen lassen (Default-Einstellung) oder aber diese identisch zum Fusionbild transferrieren. Dies ist unter 'Project' -> 'Properties' im 'Spots' Tab einstellbar.

Auch wenn ein Spot in nur wenigen Bildern des Projektes sichtbar ist, wird er und sein Umriss durch Anwendung des Union Fusion Algorithmus und Detektion auf der Fusion immer im Fuisonsblid erscheinen und detektiert werden. Der Transfer auch auf Bilder ohne Spotsignal ermöglicht Delta2D, innerhalb des übertragenen Spotumrisses eine Quantität nahe '0' zu ermitteln. Dieser Wert wird mit in das Expressionprofil aufgenommen. Derart vervollständigte Expressionsprofile erleichtern gegenüber lückenhaften Datenreihen spätere statistische Auswertungen erheblich.

Um quantitative Spot-Expressionsprofile anzusehen, wählen Sie bitte 'Window' -> 'Quantitation Table'. Die Delta2D Quantitation Table wird geöffnet.

Bevor Sie allerdings Näheres über die Quantifizierungstabelle erfahren, sollen Sie zunächst mit einigen Visualisierungsverfahren für die Auswertung von Expressionsprofilen in Delta2D vertraut gemacht werden.