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Warping mit der Smart Vectors^TM HQ Technologie

Hintergrund: Warum ist Warping für die Auswertung von 2D Gelbildern so wichtig?

In der Praxis treten Spots des gleichen Proteins auf verschiedenen Gelen nie exakt an gleicher Position auf. Diese Laufunterschiede sind die Ursache für die Ineffizienz 'traditioneller' 2D-Gelbildauswertungspakete, die echtes Warping nicht beherrschen.

Gelbild mit Gitter	Das gleiche Gelbild nach dem Warping

Wenn Sie bereits 'traditionelle' 2D-Gelauswertungssoftware kennenlernen durften, haben Sie wahrscheinlich auch schon die 'automatisch' gefundenen Matchings auf Basis der Spotumrisse in langwieriger und ermüdender Kleinarbeit korrigieren müssen.
Mit einer Bildverarbeitungsmethode namens Warping gleicht Delta2D Laufunterschiede zwischen 2D-Gelbildern schon vor Spotdetektion und quantitativer Analyse aus: Das Ergebnis sind scheinbar perfekte Gele, auf denen gleiche Spots immer an gleichen Positionen auftreten.
DECODON führte im Jahr 2000 mit Delta2D 1.0 das Warping für die Auswertung von 2D Gelbildern ein.

DIGE und andere Multiplex Techniken ermöglichen es, mehrere Proben auf einem Gel zu trennen. Dadurch wird das Problem unterschiedlicher Spotpositionen etwas gemildert. Zwischen den verschiedenen Gelen treten jedoch immer noch Laufunterschiede auf.

Im Folgenden sehen Sie zwei Gelbilder in zwei Farbkanälen auf einem Dual Channel Bild: Ein Gelbild wurde durch Delta2D orange, das andere blau eingefärbt. Ohne Warping (links) fällt es relativ schwer, gleiche Spots zu finden.

Zwei noch ungewarpte Gelbilder in einem Dual Channel Bild.	Zwei gewarpte Gelbilder auf einem Dual Channel Bild. Unterschiede in der Expression sind klar sichtbar. Durch das Warping kann Delta2D gleiche Bildpositionen über ein ganzes Projekt einander zuordnen. Dies ermöglicht beispielsweise 100%iges Spot Matching und Bildfusion.

Die gewarpten Bilder in der Dual Channel Ansicht erlauben eine qualitative Analyse der Spotmuster: Blaue Spots sind stärker auf Gel A, orange stärker auf Gel B exprimiert. Dunkle Farben deuten auf Spots gleicher oder ähnlicher Intensität hin.
Neben der Erzeugung von Dual Channel Bildern basieren noch weitere Schlüsseltechnologien von Delta2D auf der Warping-Korrektur von Gelbildern. Dazu gehören:

• 100%iges Spotmatching
  Sie erreichen eine weit höhere statistische Verlässlichkeit bei der Auswertung von Expressionsprofilen.
• Bildfusion
  Sie erreichen eine weit höhere statistische Verlässlichkeit bei der Auswertung von Expressionsprofilen.
• Proteomkarten
  Sie katalogisieren ihre Proteinidentifikationen als Annotationen.
• Color Coding
  Um Spots mit ähnlichen Expressionsprofilen zu erkennen, können Sie das 'Color Coding', welches auf Bildfusion und 100% Spot Matching aufbaut, verwenden.

Definieren einer Warping Strategy

Sie brauchen nicht für jede mögliche Kombination von Gelbildern ein Warping zu ermitteln: Das Warping für ein ganzes Projekt mit n Gelen basiert auf exakt n-1 paarweisen Warpings: Gibt es ein Warping zwischen Gel A und Gel B sowie eines zwischen Gel B und C, dann kann Delta2D - 'implizit' - ein Warping zwischen A und C erzeugen.

Implizites Warping

Eine Warping Strategie beschreibt, welche paarweisen direkten Warpings Delta2D verwenden wird, um das gesamte Warping (d. h. jede mögliche Kombination von Gelbildern) für Ihr Projekt zu berechnen.
Für unser Beispielprojekt verwenden Sie bitte die 'Group Warping' Strategie: Diese Strategie verbindet jeweils beide Gelbilder der Replikatgruppen mit dem 'Automatic' Warp Mode. Um die drei Replikatgruppen zu verknüpfen, werden die jeweils ersten Bilder der zweiten und dritten Gruppe ('1min' und '10min' Gruppe) mit dem ersten Bild der 'control' Gruppe (control_01) durch 'Automatic' Warp verbunden.

Öffnen Sie dazu 'Project' -> 'Warp Strategy...' aus dem Menü des Project Manager und wählen Sie die 'Group Warping Strategy' aus. Der 'Automatic' Warp Mode ist für die Warpings innerhalb sowie zwischen den Gruppen voreingestellt. Bestätigen Sie mit OK, um die gewählten Einstellungen auf das Projekt anzuwenden.
Die Group Warping Strategy empfiehlt sich für die meisten Projekte mit Replikatgruppen. 'Verwandte' Gele, wie eben Replikate, sollten aufgrund ihrer hohen Ähnlichkeit immer direkt und wenn möglich automatisch gewarpt werden. Im Manual finden Sie unter 'Defining a Warp Strategy for the Complete Project' weitere Informationen.

Warping Strategy Manager

Sie können auch für jede Zelle im Project Manager separat den Warp Mode über das Kontextmenü (Rechts-Klick auf die jeweilige Zelle) auswählen. Der Warping Strategy Dialog vereinfacht allerdings diesen Prozess und sorgt dafür, dass kein Gelpaar vergessen wird.

Der zugewiesene 'Automatic' Warp Mode nutzt die Delta2D SmartVectorsTM Technologie. Diese liefert Match-Vektoren, die korrespondierende Spots automatisch finden und miteinander verbinden. Überprüfen Sie bitte immer die Qualität des 'Automatic' Warp Mode für die entsprechenden Dual Channel Bilder. Falls nötig verbessern Sie das Warping wie unten beschrieben.

Der Warping Strategy Manager überschreibt vorherige manuelle Einstellungen für das Warping. Bestehende Match-Vektoren werden nicht verändert - aber ggf. nicht mehr verwendet. Um Irritationen zu vermeiden sollten Sie den Warping Strategy Manager direkt nach dem Organisieren eines neuen Projektes und später möglichst nicht mehr benutzen.

Im Project Manager sehen Sie nun, dass die vielen roten Icons verschwunden sind und die verbliebenen Icons gelb eingefärbt wurden:

Definieren einer Warping Strategie. Beachten Sie die Tool Tips, die über den Zellen erscheinen, sobald man sie mit dem Mauszeiger überfährt.

Die Warping Strategie verbindet also Bilder innerhalb der Gruppen sowie zwischen den Gruppen hier mit dem 'Automatic' Warp Mode. Alle verbleibenden Gelbilder werden von Delta2D selbständig 'implicit' verbunden.

Der Project Manager zeigt Ihnen genau dies an: Ein gelber Kreis bedeutet, dass die Bilder dieser Zeile und dieser Spalte direkt gewarpt werden. Alle anderen möglichen Kombinationen werden durch Nutzung zweier oder mehrerer direkter Warpings implizit erreicht. Gelbe Icons deuten aber auch darauf hin, dass für diese Gelbild-Paare von Ihnen noch Zeit investiert werden muss. Durch das Erzeugen von Match-Vektoren für jedes dieser Paare - automatisch und/oder manuell - kann Delta2D alle Laufunterschiede im gesamten Projekt ausgleichen.

Wenn 'Automatic' Warpings verwendet werden, kann Delta2D diese auch automatisch berechnen. Wählen Sie dazu 'Window' -> 'Job Manager' und klicken Sie auf den 'Start' Button. Der Job Manager wird die Warping-Vorgänge durchführen und überwachen.

Eine Warping Strategie für DIGE
und andere Multiplex-Projekte definieren

Delta2D bietet eine spezielle Warping Strategie für DIGE und andere Multiplex Experimente mit Internen Standards an. Gelbilder vom gleichen Gel müssen nicht korrigiert werden, da es zwischen diesen Bildern keine Laufunterschiede gibt. Für Warpings zwischen den Gelen verwenden wir die Bilder mit dem Internen Standard. Dieser repräsentiert immer das gleiche Proteingemisch und sollte aufgrund des identischen Musters einfach gewarpt werden können.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie bitte sicher, dass Sie 'Use Internal Standard' in den 'Project Properties' aktiviert und die richtigen Gelbilder als Standard-Bilder definiert haben.

Öffnen Sie aus dem Menü des Project Manager 'Project' -> 'Warp Strategy' und wählen Sie die 'In-Gel Standard Warping Strategy' aus.
Der Warp Mode zwischen Bildern eines Gels sollte 'Identical', derjenige zwischen den Gelen 'Automatic' sein. Bestätigen Sie mit OK, um die gewählte Strategie anzuwenden.

Der Warp Mode 'Identical' bedeutet, dass Delta2D die Bilder ohne Warping verwendet. Dies trifft für die drei Gelbilder pro Gel im DIGE Setup zu. Natürlich können Sie diese Einstellung auch ändern (z.B. wenn es eine kleine Verschiebung zwischen den Bildern während des Scannens gab).

Warp Manager: In-Gel Standard Warping Strategy

SmartVectors^TM HQ: Match Vektoren automatisch finden

Nutzen Sie diese Technologie, um ein Warping automatisch zu produzieren: Für jedes direkte Warping sehen Sie zunächst ein gelbes Icon im Project Manager. Das Warping in Delta2D basiert auf sog. Match-Vektoren, die mit Hilfe der SmartVectors^TM HQ Technologie schnell und zuverlässig gefunden werden.

Im Project Manager sehen Sie eine tabellarische Übersicht aller Bilder des Projektes. Um ein Gelbildpaar als Dual Channel Image in der Dual View zu öffnen, fahren Sie mit Ihrer Maus auf die Zelle, bei der die Zeile eines Bildes (z.B. 'control_01') auf die Spalte eines anderen (z.B. 'control_02') trifft. Klicken Sie nun auf den erscheinenden 'View' Button. Ein neues Fenster (die 'Dual View') zeigt die Falschfarben-Überlagerung der beiden Bilder (z.B. 'control_01' in blau und 'control_02' in orange). Dadurch können Sie nach dem Warping Unterschiede zwischen Spotmustern sehen: Schwarze oder graue Spots haben auf beiden Bildern nahezu die gleiche Intensität. Orange Spots sind stärker auf control_02, blaue Spots sind dort schwächer. Je mehr die Farbe der Spots zu einem der Extreme tendiert, desto größer ist der Unterschied in der Expression.

Dual Channel Bild zweier ungewarpter Gelbilder

Wenn Sie ein DIGE Projekt auswerten, öffnen Sie bitte die Dual Views der Internen Standard Bilder verschiedener Gele für das Warping.

Natürlich können Sie jederzeit verschiedene Regionen oder die Dual Channel Bilder komplett ansehen, hinein- oder herauszoomen oder nur die Einzelbilder anschauen. Zudem kann die Darstellung der Bilder über 'Histograms...' () aus dem Menü 'Images' verändert werden. Schieberegler verwenden Sie zur Anpassung der Einstellungen. Mit dem Equalize Button () lassen sich die Bilder ausbalancieren. Änderungen wirken sich lediglich auf die Darstellung, nicht aber auf die Quantifizierung aus, da diese stets nur auf den Originalbildern erfolgt. Bitte kontrollieren Sie auch, ob der Bildhintergrund durch den Background Button ()versteckt wurde. Diese Einstellung hilft, unterschiedliche Spotpositionen besser zu erkennen. Bestätigen Sie mit OK.

Histogram Settings Dialog

Klicken Sie nun auf den 'Find Match Vectors' Button in der Dual View, damit Delta2D's SmartVectors^TM HQ Technologie die Vektoren für das aktuelle Gelpaar findet. Ist der Vorgang beendet, wird der Warp Mode auf 'exact' geändert.
Automatisch erzeugte Vektoren werden - anders als manuell gesetzte - als gestrichelte Linien gezeichnet. Haben Sie einen automatisch generierten Vektor bestätigt oder einen neuen Vektor gesetzt, so werden diese mit durchgehender Linie dargestellt.

Delta2D unterscheidet zwischen manuell gesetzten (durchgezeichnete Linie) und automatisch gefundenen (gestrichelte Linie) Vektoren. Durch Bestätigung eines automatisch gefundenen Match-Vektors (Rechtsklick auf den Vektor und 'Approve') wird er wie ein manuell gesetzter behandelt.

Klicken Sie nun auf den Warp Button () und Delta2D wird die Bilder entsprechend der Match Map aufeinander anpassen. In der daraus resultierenden gewarpten Ansicht können Sie die Unterschiede im Expressionsniveau gleicher Spots - wenn die Laufunterschiede vollständig ausgeglichen wurden - schnell erfassen. Unvollständig gewarpte Regionen zeigen nebeneinander oder teilweise überlagerte gleiche Spotmuster in orange und blau. Delta2D erzeugt i.d.R. nur dann Match-Vektoren, wenn die entsprechenden Gel-Regionen dies in ausreichender Qualität zulassen. Sie können die Bilder jederzeit wieder in den Urzustand versetzen, sie also 'entwarpen' (Unwarp Button ), um die Vektoren anhand der Originalbilder zu beurteilen und u. U. zu korrigieren.

Sie können den 'Find Match Vectors' Button auch mehrfach verwenden. Delta2D's SmartVectors^TM HQ Technologie wird schon bestehende Vektoren als Basis für die Detektion weiterer Vektoren nutzen und steigert somit die Verlässlichkeit des Ergebnisses:

Klicken Sie auf den 'Find Match Vectors' Button. Delta2D fragt Sie zunächst, was mit den vorher von der Automatik gefundenen Vektoren geschehen soll: Sie können diese als Grundlage für die zweite Iteration mit SmartVectors^TM verwenden oder auch verwerfen.

Sobald es für ein Bildpaar mindestens einen bestätigten Vektor (manuell gesetzt oder automatisch gefunden und manuell bestätigt) gibt, ändert das Icon im Project Manager die Farbe von gelb nach grün. So wissen Sie, dass Sie bereits an diesem Paar gearbeitet haben. Sie sollten generell nach der Fertigstellung eines Warpings alle Vektoren bestätigen (im Menü: 'Matches' -> 'Select Non-Approved', und dann 'Matches' -> 'Approve Selected').

Manuelles Erstellen, Löschen und Ändern von Match Vektoren

Um mit den Match Vektoren zu arbeiten, selektieren Sie bitte das Match Vector Tool: Klicken Sie auf den obersten Button im linken senkrechten Tool Panel der Dual View.

Manchmal ist es notwendig, automatisch gefundene Match Vektoren zu korrigieren. Wir empfehlen, dabei mit größeren Bildregionen zu arbeiten (nicht mit einzelnen Spots). Falls einer oder mehrere Match-Vektoren korrigiert werden müssen, löschen Sie einfach alle Vektoren dieser Region (Rechtsklick und 'Delete') und klicken Sie nochmals auf 'Find Match Vectors', um mit SmartVectors^TM bessere zu finden. Benachbarte Vektoren verbessern das Ergebnis der neuen Iteration.

Dual View nach dem Warping

Mit Match-Vektoren sind die folgenden Operationen möglich:

• Selektieren eines einzelnen Match-Vektors
  Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den jeweiligen Vektor - selektierte Vektoren werden hervorgehoben.
• Selektieren mehrerer Match-Vektoren in einer Region
  Ziehen Sie mit der gedrückten linken Maustaste ein Rechteck um die zu selektierenden Vektoren.
• Löschen von Match-Vektoren
  Klicken Sie einen Vektor mit der rechten Maustaste an und wählen Sie 'Delete' bzw. 'Delete Selected' um den oder die selektierten Vektoren zu löschen.
• Neue Match-Vektoren setzen
  Klicken Sie zunächst auf den Spot im orangen Bild und dann auf den dazugehörigen im blauen Bild. Die Spots sind nun durch einen Vektor verbunden, dessen Enden nach einem Klick auf den Warp Button übereinandergezogen werden.
• Ändern von Match-Vektoren
  Ziehen Sie an nur einem Ende des Vektors, um dessen Position zu verändern (z. B. einem anderen Spot zuweisen, Position auf dem 'Zielspot' optimieren, etc.).

Match-Vektor Operationen können über 'Edit' -> 'Undo' () rückgängig gemacht werden.

Klicken Sie auf den Warp Button, um die Auswirkungen der neuen Vektoren zu sehen. Sie können Match-Vektoren iterativ hinzufügen, korrigieren oder löschen, bis Sie mit dem Ergebnis zufrieden sind.

Ergebnisse verifizieren

Da die gesamte Auswertung von der Qualität des Warpings abhängt, sollte diesem Schritt viel Aufmerksamkeit geschenkt werden. Für die Sicherung ausreichender Qualität empfehlen wir, folgende Punkte kritisch zu überprüfen:

• Im Project Manager sollten Sie nur Zellen mit grünen Icons oder ohne Icon sehen.
• Für jedes direkt gewarpte Gelbildpaar (jede Zelle im Project Manager mit einem grünen Icon) öffnen Sie bitte die Dual View und sichern Sie für das gewarpte Dual Channel Bild vollständige Deckungsgleichheit der Spotmuster.
• Stellen Sie kurzzeitig den exact in den global-Warp Modus um (und nach der Prüfung unbedingt wieder zurück!). Ausreißer und evt. fehlerhafte Vektoren lassen sich so sehr schnell erkennen.

Fahren Sie erst fort, wenn Sie mit dem Warping-Ergebnis zufrieden und keine Korrekturen mehr notwendig sind.

Die Beispieldaten enthalten auch fertige Match Maps. Zur Einschätzung, dass Sie alles richtig gemacht haben, können Sie diese auch für die jeweiligen Bildpaare importieren: Im Menü 'Matches' wählen Sie dazu 'Import'. Falls ein blaues Match Vektor-Ende auf einen orangen Spot zeigt und andersherum, haben die Vektoren die falsche Richtung. Wählen Sie in diesem Fall: 'Matches' -> 'Invert'