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Análisis Cuantitativo de los Datos

Für eine qualitative Analyse eines Gelbild-Paares anhand der Farben im Dual Channel Bild konsultieren Sie bitte den Abschnitt 'Warum ist Warping für die Auswertung von 2D Gelbildern so wichtig?'.

Encontrar spots interesantes con un Scatter Plot

Un método para encontrar spots interesantes se basa en comparar sus niveles de expresión en dos imágenes.
Haga clic en el menú Dual View `Spots` -> 'Show Scatter Plot' para abrír un gráfico de las imágenes.

Scatter Plot

La posición de un spot se determina por su volumen normalizado en cada imagen: en éste ejemplo la posición X corresponde a la cantidad de 'control_01' y la posición Y a la cantidad de '1min_01'. Así pues, spots con el mismo volumen en las dos imágenes aparecen en la línea de 45 grados del diagrama, spots inducidos los encontarmos en la mitad izquierda más alta y spots reprimidos en la mitad más baja. Ahora haga clic sobre uno de los extremos del spot de la mitad de arriba o la de abajo y seleccionar éste en todas las demás ventanas de Delta2D. Ud. puede ver ahora dicho spot en Dual View de pares, en la tabla cuantitativa con sus respectivas informaciones cuantitativas, una presentación multiple de geles.

Encontrar Spots interesantes por sus Perfiles de Expresión

Los perfiles de expresión de cada spot podrán ser vistos a travéz de un Rollup, en Dual View, haga clic en Dual View 'Rollups' -> 'Expression Perfiles' para abrir una pequeña ventana delante de la ventana original de Dual View. Èsta es una de los así llamados `Rollups`.

Active 'Spot Selection Tool' y simplemente mueva el puntero de su ratón hacia un spot determinado.

El rollup del perfil de expresión indica la intesi-dad del spot durante todo el proyecto.

La altura de cada barra está determinado por el volumen relativo (% volumen) del spot, e intensidad del spot, después de la sustracción del fondo y normalización de las determinadas imágenes de gel. Mueva ahora el puntero de su ratón al siguiente spot para ver su perfil de expresión en el Rollup.

Filtrado de Perfiles de Expresión interesantes en la Tabla

Abra la tabla de cuantificación a travéz del menú `Window`. La ventana de la tabla de cuantificación muestra tres vistas diferentes de los datos cuantitativos de los spots:

• Vista de los datos de los spots de un solo imagen de gel
  Indica el volumen relativo (%V), area e ID. '%Vol' es el resultado después de la sus-tracción de fondo, la cuantificación y normalización. Ud. puede llamar los datos de los spots para cada imagen de gel haciendo clic en la tecla izquierda de su ratón sobre la imagen de gel en el Tab descrito con su respectivo nombre.
• Vista de datos de spots de todas las imágenes de gel 'All gel images'
  Muestra los datos de los spots para todas las imágenes de gel del proyecto con un perfil de expresión de cada spot en cada línea. Además de poseer columnas de '%Vol' ésta tabla cuenta también con columnas radio 'Ratios' los cuales muestran las pro-porciones de las expresiones con códigos de colores así como numericamente. Todos los valores de `Ratio` se refieren al `Ratio Master`. Este puede ser cambiado haciendo clic en 'Columns' -> 'Table properties'. Aquí también pueden elejirse columnas addicionales.

Tabla cuantitativa - 'Statistics View'

• Vista estadística 'Statistics View'
  Muestra además de los volumenes relativos de los spots también el valor medio, mediano y desviación relativa estándar de cada grupo seleccionado, así como el valor de la tabla t-test referente al primer grupo. Los valores de `Ratio` serán calculados como cociente del valor medio del grupo y el valor medio del primer grupo.

La tabla de cuantificación se sincronizará con todas las demás vistas en Delta2D: la elección de un perfil de expresión aquí (en consecuencia una línea) selecciona también el spot en todas las demás ventanas, por ejemplo, en Dual View.

Ventana de diálogo de Filtro

Delta2D ofrece muchas herramientas para encontrar según su criterio perfiles especialmente interesantes. Ud. podrá por ejemplo buscar spots cuya intensidad tratada en am-bos grupos es 2 veces más fuerte ó débil en comparación con los grupos control exprimidos. Èste factor 2 debe corresponder al valor medio de los grupos de réplicas, por eso el valor medio de los grupos '1min' y '10min' debería ser por lo menos dos veces más alto o bajo que el valor medio del grupo 'control'.

Para solo ver los spots que correspondan con éste criterio, siga los siguientes pasos:

1. Abra la tabla de cuantificación y seleccione el Tab 'Statistics'.
2. Buscamos ahora la columna 'Ratio mean % volume 1min / mean % volume control'. Para ver el nombre de la columna: arrastre la línea entre dos columnas o vaya con el puntero de su ratón sobre la cabeza de la columna y espere hasta que aparezca el nombre. Haga ahora clic sobre el botón 'Filter' de la columna y así abrir la ventana de diálogo respectiva.
3. Dé ahora los límites de filtrado '0.5' y '2' en las casillas 'Show values from ... to ...'. (como alternativa también puede utilizar la reglilla reguladora debajo del histograma), active ahora 'Negated' ('Filter active' será activado automáticamente en cuanto confirme con OK). En el histograma ahora podrá ver la distribución de los ratios.
4. 4. Confirme con OK para aceptar los ajustes y así ver ahora en la tabla solamente los spots con los criterios correspondientes.

Repita los pasos 2. -> 4. veáse arriba en la columna 'Ratio mean % volume 10min / mean % volume control'.
Ahora abra Dual View con 'control_01' y '1min_01': solo los spots que responden a nuestros criterios serán mostrados con sus perfiles.

Análisis estadístico avanzado

Delta2D fueron introducidos para el análisis los métodos de Clustering de variantes estadísticas multiples, y de reducción de las dimensiones de grandes estimaciones de datos, a éstos pertenecen entre otros:

• Heatmaps para visualizar los perfiles de expresión de spots,
• Métodos para clustering de spots, imágenes de gel, etc.,
• Diversos Sub-tipos del t-test,
• Análisis de variantes simple y de doble factor (ANOVA),
• Pavlides Template Matching (PTM),
• Análisis de componentes prinzipales (PCA - Principal Component Analysis.

Los métodos aquí descritos se basan en el análisis de algoritmos para análisis de DNA ‘microarrays’, ya establecidos en TIGR MeV (Multiple Experiment Viewer). De ahí que, ya que Delta2D 100% Spot Matching - equivalente para DNA microarrays, se preocupa por obtener perfiles de expresión completos, podríamos también ahora hacer éste procedimiento disponible para el análisis de geles 2D.

Para la mayoría de los métodos estadísticos es recomendado utilizar por lo menos 4 réplicas y hasta 10 en algunos métodos. Aunque nuestro proyecto modelo solo contiene dos réplicas por grupo, y es demasiado pequeño para un análisis que tenga sentido puede explicar el provecho de los métodos singulares.

Para un análisis ejemplo abrirémos la tabla cuantitativa 'Statistics'. Primero oculte los datos de imágenes de fusión, porque si nó los datos de éste gel artificial serían utilizado como datos normales. Haga clic en 'Column' - 'Column Properties' y desactive la función Checkbox al lado del imagen de fusión. Confirme con 'OK' para excluir la imagen de fusión del análisis.

Adquirir una Vista general de los Perfiles de Expresión utilizando Heatmaps

Haga clic en 'Analyze' en la parte izquierda arriba de la tabla estadística para abrir una la ventana de análisis TMEV. Èsta contiene una ventana de diálogo llamada 'Heatmap' con los perfiles de expresión. Cada línea corresponde a un perfíl de expresión de un spot, en cada columna se ve una imagen del gel. Spot Labels serán mostrados en la parte derecha tan pronto estén presentes. Con la creación de Heatmap se han normalizado y estan-darizado los datos para una mejor comparabilidad.

La leyenda en la orilla de arriba aclara el código de colores empleados para la intensidad de spots. (Izquierda: expresión de bajo promedio centro: expresión de promedio medio, a la derecha: expresión sobre el nivel promedio).

Heatmap para el proyecto Ejemplo.

Clasificación de los Datos de Expresión en Grupos de Regulación

Para la clasificación de perfiles de expresión parecidos se puede hacer un Clustering jerár-quico como primer paso para evaluar la calidad de los datos cuantitativos. Haga clic en el botón 'HCL' en la lista de herramientas. Utilize 'Gene Tree' para encontrar genes con un perfil de expresión parecida, 'Euclidian Distance' como médida de similitud y 'Complete Linkage' para la construcción del cluster. Confirme los ajustes con OK. Perfiles de expresión (spots) serán agrupados según su similaridad.

Clustering jerárquico en los perfiles de expresión.

El gráfico de formato arbol resalta semejanzas entre los perfiles de expresión. Haciendo clic con la tecla izquierda en un subarbol y todas las proteinas spots de clases semejantes. Grupos de regulación serán seleccionados. Ya que aquí la selección se produce sincró-nicamente, Ud. podrá ver también inmediatamente en imagen de Dual View o en la tabla de cuantificación todos los spots exprimidos parecidos

Clustering jerárquico en los per-files de expresión.

Si Ud. quiere definir la estructura de un experimento también puede hacer clusters a travéz de HCL. En este caso por favor seleccione Sample Tree (imágenes de gel). Aquí deberían por ejemplo aparecer por razones de similitud en el mismo Cluster (subarbol) las imágenes de las réplicas.

Encontrar perfiles modelo con Template Matching

Utilizando Template Matching Ud. puede encontrar perfiles de expresión con perfíl modelo semejantes.

Active el mando PTM en la ventana de TMEV. En la parte inferior de la caja de diálogo Ud. verá algunas reglillas reguladoras movibles, con éstas se puede definir apróximadamente los ajustes de un perfil modelo que sea interesante para Ud. Tan pronto Ud. haya definido un perfil conforme con sus deseos confirme éste con OK.

Perfiles de expresión ajustado a un template.

TMEV muestra a travéz del Heatmap el Template definido, y bajo éste todos los perfiles de expresión semejantes con su perfil deseado.

Encontrar Significancias, Diferenciales exprimidos de Spots de Proteinas: Testos Estadísticos

Delta2D ofrece diversos métodos para controlar la proporción de resultados falsos positivos (FDR=False Discovery Rate) de spots encontrados erroneamente como significancia direrencial exprimida. El así llamado (FDR=False Discovery Rate), hace posible mantener el balance entre la necesidad de encontrar spots de diferencial exprimido y los costos que se producen a travéz del seguimiento de proteinas falsas positivas.

Seleccione en la ventana de diálogo t-test - ‘p-values, basados en permutaciones’, y ‘Stepdown Westfall and Young methods’. Dé a éstos los límites para un máximo de spots falsos positivos encontrados, bajo la function 'The number of false positive genes should not exceed'. Naturalmente Ud. podrá asignar éste valor también en porcentajes en ('The proportion of false positive genes should not exceed').

Parametros del t-test.

Con TMEV Delta2D ofrece además otras posibilidades para el análisis estadístico. Para saber más al respecto por favor consulte el manual de Delta2D o TMEV.