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Perfil de Expresión Total y 100% Spot matching

Delta2D's 100% Spot Matching se basa en un método muy avanzado para el trabajo de imágenes, y fue introducido por DECODON en el año 2003. Una presentación general de éste lo encontrará bajo la página Web: "100% Spot Matching".
100% Spot Matching garantizan perfiles de expresión total para cada proteina. Esto con-lleva una mejor significancia en la credibilidad estadística de los datos cuantitativos, de tal manera que Ud. podrá encontrar por ejemplo en un experimento más candidatos para Biomarcas. Estimaciones alternativas en el análisis de gel 2D (por ejemplo reconocimiento por separado de spots para cada imagen de gel) pueden conllevar a falsos Matchings o fallas en las apreciaciones en los perfiles de expresión.

Arrancando de un proyecto con Warpings totales y valiosos cualitativamente, se hará entonces el análisis cuantitativo en Delta2D en tres pasos:

1. Con Fusión de imágenes creé Ud. una imagen, la cual contenga todos los spots del proyecto completo.
2. Creé Ud. una máscara de spots homogénea con todos los spots existentes en todo el proyecto a travéz de la detección de spots a partír de la fusión de imágenes.
3. Con la transferencia (‘Transfer’) de la máscara de spots a todas las imágenes originales hacen finalmente posible la cuantificación de algunos spots conseguidos.

Crear una Fusión de Imágenes

La fusión de imágenes (tipo de fusión 'Union') junta todos los spots del experimento y sirve de base para la detección homogénea de spots y para total spot Matching. La fusión de imágenes utiliza las informaciones de todos los vectores puestos para el Warping y combina las imágenes de gel con exactitud de Pixels, y crea así una nueva imagen.
El re-sultado es una imagen de gel artificial con verdaderas formas de spot, la cual reune las características típicas de las imágenes originales.

Hay muchas aplicaciones posibles de imágenes fusionandas. Ud. puede utilizar imágenes fusionadas por ejemplo, como ‘Mapa de Proteomas’ con todas las anotaciones de spots acumuladas. Además Ud. puede visualizar en imágenes fusionadas un gran número de análisis de resultados. Con el tipo de fusión ‘average’, compense Ud. fluctuaciones experimentales, combinando varias réplicas hacia una imagen de perfíl medio. Grandes números de imágenes de gel Ud. podrá resumirlas en una sola imagen representativa

Para poder continuar con el análisis, crearemos ahora una imagen de fusión para nuestro proyecto. En Project Manager haga clic con la tecla derecha de su ratón sobre la primera imagen ('control_01') y escoja en menú de contexto 'Fuse all Images', aquí se abrirá una nueva ventana de diálogo para ajustar los parámetros de fusión, deje 'control_01' como 'Master Gel Image' y escoja 'Union' como 'Fusion Type' para el ajuste de un mapa de proteomas. No cambie los demás ajustes, para iniciar la fusión de imágenes haga clic sobre 'Fuse'. Una vez finalizado el ajuste aparecerá la imagen de fusión en un otro grupo de nombre 'Fused Images'.
Abra ahora ésta imágen fusionada en Dual View, para esto haga doble clic sobre la celda directámente bajo la imagen de fusión en Project Manager. Dual View le mostrará ahora la imagen de fusión junto con 'control_01', por el momento podemos ignorar 'control_01' y así concentrarnos en la imagen de fusión. Entonces haga por favor clic en la ventana abajo sobre el tabulador con el nombre de la imagen de fusión.

La imagen de fusión se vé como una verdadera imagen de gel, esto es posible a travéz de la combinación de Pixels de todas las imágenes con una función media ponderada. Pero lo más importante es que la fusión 'Union' contenga ó incluya todos los spots del proyecto como un mapa de proteomas, también aquellos que solo se presentan en una o dos imágenes.

Para proyectos DIGE están descartadas para la fusión, imágenes con el estándar interno, (normalmente imágenes coloradas con Cy2), ya que éstas no contienen ninguna información extra en comparación con las imágenes de pruebas únicas.

Detección de Spots a partír de la Imagen de Fusión

Deje abierta la función Dual View, vaya a vista única de fusión, escoja 'Spots' -> 'Detect Spots on Fused Image' para iniciar la detección, se abrirá entonces una nueva ventana de diálogo para poder definer los parámetros de detección, confirme los valores dados con OK, ya que éstos en la mayoría de los casos arrojan los mejores resultados.

Los parámetros recomendados serán derivarán de la imagen actual, lo que conducirá hacia una detección de spots mucho más sensitiva. El filtrado de falsos spots positivos se hace más tarde mucho más efectiva y rápida que la adición manual de spots no detectado.

Edición de Spots a partír de la Imagen de Fusión

Ud. podrá optimizar los resultados de detección automática de Delta2D a travéz de la función ‘Spot editing’. Para ésto existen tres operaciones básicas: adiccionar un nuevo spot, dividir spots y juntar spots. En todo caso Delta2D hará el cálculo de perfíl de los spots automáticamente. Èsta acción para la edición de spots, asegura lo mayor posible, independientemente del usuario, la posibilidad de reproducción, y asegura al mismo tiem-po la posibilidad de adaptación para la detección de spots.

Para la edición de spots Ud. primeramente tiene que activar la función ‘Spot Editing Tool’: haga clic sobre el tercer botón del panel de herramientas vertical izquierdo de Dual View.

Adiccionar un Nuevo Spot a partír de la Imagen de Fusión

Para adiccionar nuevos spots, haga clic sobre el centro de spots, de los spots a detectar. Se creará una nueva marca (símbolo '+') para calcular el nuevo perfíl del spot.

Región de Imagen, antes y después de la adicción manual de un spot

Unir Spots

Spots vecinos pueden ser unidos con la función 'Line-Marker'. Para unir dos ó más spots en uno sólo, conecte o una éstos uno con otro manteniendo presionada con la tecla izquierda de su ratón el centro de cada spot. La recién creada ‘Line-Marker’ sirve como base para el cálculo de un nuevo perfíl de spot, el cual contiene todos los spots, cuyos centros han sido fusionados a travéz del Marker.

Ejemplo de spots que han sido unidos.

Separar Spots

Delta2D detecta a veces solo un spot, donde Ud. quisíera detectar 2 ó más. Haga clic una vez sobre el centro del spot que no ha sido detectado. Un Marker aparecerá y Delta2D podrá hacer el cálculo de un nuevo perfíl, éste podrá variar dependiendo de la posición del Marker.

Un grupo de spots, que falsamente solamente fueron detectados como un spot, pero que fueron separados a travéz del Marker.

Mover y Borrar Spot Markers

Spot Markers (rotuladores de spots) podrán ser movidas arrastrandolas con la tecla iz-quierda de su ratón. Para el borrado haga sencíllamente clic con la tecla derecha de su ratón sobre la misma. Mover y borrar Spors-Markers, cambian el profíl de los spots, inclu-yendo también los spots vecinos, ya que éstos despues de ambas acciones deberán ser cálculadas nuevamente.

Remover Spots

Para remover spots active por favor la función 'Spot Selection Tool', haga clic ahora con la tecla derecha de su ratón sobre los respectivos spots y escoja 'Cancel'. Para poder remover una región completa de falsos spots positivos, como por ejemplo en las orillas del gel, arrastre con la tecla izquierda de su ratón un pequeño cuadro alrededor de éste spot y cancele éste haciendo clic con la tecla derecha y seleccione 'Cancel Selected'.
A travéz de 'Spots' -> 'Show Cancelled Spots' Ud. podrá ver los spots que han sido removidos (spots-perfíl en lineas discontinues), y ó adiccionarlos nuevamente (Clic en la tecla derecha de su ratón y luego haga nuevamente clic en 'Cancel').

Filtrado de Spots Falsos Positivos

Delta2D envía por regla general spots patrones muy bien detectados, sin embargo, debido a contaminaciones, huellas digitales, burbujas, etc., se pueden obtener detecciones de falsos spots falsos positivos. Èstos artefactos no tienen en Vista 3D la forma típica de un spot y son en la mayoría de los casos muy débiles.
En caso de que se detecten demasiados spots débiles, Ud. podrá reducir los parámetros de sensibilidad ('Sensitivity') en la ventana de diálogo de detección de spots, y luego hacer una nueva detección. Delta2D calcula un ‘spot quality’ parametro para cada spot que haya sido detectado. Èste valor señala que tanto un spot corresponde al modelo 3D ideal de Gauss (entre mayor sea el valor, mucho mejor máximo '1'). Con ayuda de éstos valores Ud. podrá filtrar spots falsos mucho más rápido:

• Abra la ventana de cuantificación 'Quantitation Table' a travéz del menú de 'Window'.
• En la tabla haga clic abajo en el Tab de la imagen de fusión.
• Busque la columna 'spot quality' y haga clic sobre el botón 'Filter'.
• En la ventana de diálogo 'Filter' Ud. puede utilizar la reglilla de ajustes, y así ajustar los límites del filtro (0.2 en la mayoría de los casos es un buen valor).
• Haga clic sobre el botón OK, para así poder ver los efectos del filtro y cerrar la ventana de diálogo.
• Controle después paralelamente en Dual View, si por razones de los valores de filtrado elegidos no hayan sido filtrados también algunos buenos spots, en ese caso ajuste el filtro nuevamente.

Recomendamos ajustar el fitro de tal manera que Ud. sólo vea spots que desea remover (por ejemplo: 'spot quality' < 0.2). Escoja 'Edit' -> 'Select all', luego 'Cancel' -> 'Cancel Selected Spots'. Ahora Ud. puede desactivar el filtro nuevamente haciendo clic en la tecla derecha de su ratón en la función Filtro y Filtro Activo (Filter-'Filter active'), desactivar haciendo clic en la tecla izquierda del ratón. Ahora todos los spots falsos positivos han sido borrados.

Ahora Ud. ha detectado los spots de la imagen de fusión, en el dado caso, también ha trabajado la detección automática de spots, y en los casos necesarios también los ha corregido. Ya que la Fusión ‘Union’ contiene todas las imágenes y spots del proyecto, se podrán aplicar ahora los patrones de perfíl de spots uniformes ya existentes para todo el proyecto en su totalidad.

Transferir Perfiles de Spots

La transferencia de perfiles de spots es el siguiente paso en camino hacia el análisis cuan-titativo, ésta es la razón de la máscara de spots en la imagen de fusión sobre todas las demás imágenes de gel. Allí se cuantificarán automáticamente todos los spots dentro de los limites de spots transferidos´.

Para la transferencia de spots haga clic en Project Manager con la tecla derecha de su ratón sobre la imagen de fusión y escoja en el menú de contexto 'Transfer Spots to Gel Image' -> 'All'. Una barra de progresos muestra que los perfiles ahora serán transcritos uno por uno, y los spots serán cuantificados a partír de las imágenes originales.
Ya que Ud. ha ejecutado la detección en una imagen de fusión tipo ‘Union’ y todos los perfiles de spots han sido transferidos desde allí, Ud. obtendrá ahora para cada spot, un Matching completo, y con ello también un perfil completo de expresión.

Perfiles de spots después de la transferencia: Para la presentación múltiple de gel utilize 'Win-dow' -> 'Gel Image Regions'. Ud. vé que cada spot en cada imagen de gel tiene exáctamente un Match Par.

SUd. puede transferir perfiles de spots a la imagen de fusión, completamente idénticos, a travéz de Delta2D, ó también adaptar el tamaño real de éstos con los respectivos spots de la imagen destino (Ajustes por Defecto), éstos pueden ajustarce bajo 'Project' -> 'Properties' en 'Spots'.

También cuando un spot es solamente visible en pocas imágenes, éste y su perfíl apare-cerá, y será detectado a travéz de la aplicación del algoritmo de fusión tipo 'Union', y la detección de fusión, siempre en la imagen de fusión. También la transferencia a imágenes sin señal de spot, hace posible que Delta2D pueda encontar los perfiles de spots transferidos con un valor cuantitativo cerca de '0'. Èste valor será tomado en el perfíl de expresión, éste tipo de perfíl de expresión final facilitará más tarde y de manera considerable el análisis estadístico frente a una raya de datos incompletos.

Para poder ver perfiles de expresiones de spots cuantitativos, vaya a 'Window' -> 'Quanti-tation Table', aquí se abrirá ‘Delta2D Quantitation Table’.

Antes de que Ud. pueda conocer la tabla de cuantificación un poco más de cerca, Ud. debería tener primero un mayor conocimiento ó dominio con algunos de los procesos de visualización en el análisis de perfíles de expresión en Delta2D.