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Warping con la Tecnología Smart Vectors^TM

Fondo: ¿Por qué Warping es muy importante para el Análisis de Imágenes de Gel 2D?

En la práctica spots de la misma proteina, en diferentes geles nunca aparecen exáctamente en la misma posición. Èstas diferencias son las consecuencias de la ineficiencia de los paquetes para el análisis de imágenes de gel tradicionales, que no controlan un verdadero warping.

Imágen de Gel con rejilla	La misma imagen de gel despues del Warping

Cuando Ud. ya ha podido conocer prógramas para el análisis de Gel ‘tradicionales’, en-tonces ha tenido Ud. posiblemente qué corregir los contornos (ó siluetas) de sus spots con largos y agotadores pequeños trabajos, que se producen a razón de las mediciones automáticas.
Con un metodo para el trabajado de imágenes llamado Warping, Delta2D equilibra, ya antes de la detección de spots, y del análisis cuantitativo, las diferencias entre las imágenes de gel. El resultado, la presencia de geles perfectos, en el cual los mismos spots aparecen siempre en la misma positión.
Delta2D introdujo en el año 2000 con la versión 1.0 los Warping para el análisis de imá-genes de gel 2D.

DIGE y otras multiples técnicas hacen posible separar varias pruebas en un mismo gel, a travéz de ésto se reducirá el problema de la diferencia de posiciones de los spots. Sin em-bargo, entre los diferentes geles aparecen todavía diferencias en las trayectorias.

En la siguiente Ud. vé 2 imágenes de gel én dos canáles de color sobre una imágen de canal dual: Una imágen de gel se volvió a travéz de Delta2D en color naranja, la otra se coloreó en azul. Sin warping (Izquierda), se vuelve relatívamente dificil conseguir los spots mismos.

2 imágenes de gel sobre una imagen de canal dual todavía sin warping.	2 imágenes de gel sobre una imágen de canal dual, colocadas una sobre la otra con Warping. Diferencias en la expresión son claramente visibles, a travéz del Warping Delta2D puede ordenar una tras otra las mismas posiciones de las imágenes a lo largo de un todo un proyecto. Èsto hace posible por ejemplo, 100% la medición de Spots y fusión de imágenes.

Las imágenes con warping en el canal dual, permite un análisis cualitativo del tipo de spot: spots en azul se expresan más fuertes sobre gel A, y naranja sobre gel B. Colores oscuros indican spots de una misma intensidad ó parecida.
Además de la producción de imágenes de canal dual, hay todavía otras tecnologías claves en Delta2D para la corrección de las imágenes de gel Warping. A éstas pertenecen:

• 100%iges Spotmatching
  Èstas alcanzan una muy alta credibilidad estadística en el análisis del perfil de las ex-presiones.
• Fusión de Imágenes
  Ud. puede a travéz de combinaciones, producir varias imágenes, por ejemplo cortes de imágenes.
• Mapa de Proteomas
  Ud. cataloga la identificación de sus proteinas como anotaciones.
• Color Coding
  Para reconocer spots con perfiles de expresiones parecidas, Ud. puede utilizar 'Color Coding' el cual está constituido por fusión de imágen y 100% spotmatching.

Delta2D's tecnología SmartVectors^TM puede producir un Warping automáticamente de imágenes de gel basadas en regiones parecidas

Defina una Estrategia Warping

Afortunadamente Ud. no necesita realizar un Warping para cada combinación posible de las imágenes de gel: el Warping para un proyecto completo está basado exáctamente de n-1 pares de warpings para (n) geles: hay un Warping entre gel A y gel B así como entre gel B y gel C, entonces Delta2D podrá implícitamente - 'implizit' - realizar un Warping entre A y C:

Warping implicado

Una estrategia Warping describe, cuales Warping Delta2D utilizará directámente de mane-ra par, y de ésta manera poder calcular el Warping completo de su proyecto. (Por éso cada posible combinación de las imágenes de gel).

Para nuestro Proyecto Ejemplo, por favor utilice Ud. la estrategia 'Group Warping' ésta estrategia une ambas imágenes de gel de los grupos de réplicas con la función 'Automatic' Warp Mode. Para unir 3 grupos de réplicas, a travéz de 'Automatic' Warp se unirán las primeras imágenes de cada grupo de réplicas (Grupos '1min' y '10min') con las primeras imágenes del Grupo ‘Control’ (control_01).
Abra para esto 'Project' -> 'Warp Strategy...' en el menú del Project Manager y escoja 'Group Warping Strategy'. Defina entonces el 'Automatic' Warp Mode para los Warpings tanto, como entre los grupos. Confirme con 'OK' para poder aplicar los ajustes elejidos sobre el proyecto.

Se recomienda Group Warping Strategy para la mayoría de los proyectos con grupos de réplicas. Para geles similares, a razón de los parecidos tan grandes, se deberían hacer siempre un Warping directo ó automático cada vez que sea posible. Ud. encontrará mayor información sobre el tema en nuestro maual bajo 'Defining a Warp Strategy for the Com-plete Project'.

Warping Strategy Manager

Ud. puede escojer el modo Warp para cada celda del Project Manager de forma separada a travéz del menú de contextos (Presione la tecla derecha de su ratón sobre la respectiva celda). En todo caso, el diálogo Warping Strategy facilita éste proceso y se encarga de que ningún gel par sea olvidado.

El ya señalado 'Automatic' Warp Mode utiliza la tecnología Delta2D SmartVectorsTM. Éste envía los Match vectores que encuentra automáticamente con los mismos spots y que están conectados entre sí. Por favor, compruebe Ud. siempre la calidad del 'Automatic' Warp Mode para las respéctivas imágenes de canal dual. En caso de ser necesario mejore Ud. la calidad del Warping como ya describiremos más tarde.

Warping Strategy Manager reescribe los ajustes manuales anteriores para el Warping. Los Match vectores ya existentes no serán cambiados, pero en el caso dado, no volverán a ser utilizados. De allí que, directámente después de la organización de un nuevo proyecto y posiblemente más tarde, Ud. no debería utilizar el Warping Strategy Manager.

En el Project Manager Ud. ahora verá que muchos de los puntos rojos desaparecieron, y los puntos restantes se han teñido de amarillo:

Defina una Estrategia Warping. Tenga en cuenta el uso de sugerencias que aparecen sobre las celdas, tan pronto como sean senaladas con el puntero del ratón.

Warping Strategie une aquí con 'Automatic' Warp Mode, tanto las imágenes dentro del grupo así como entre los grupos. Todas las imágenes de gel restantes serán unidas independientemente, implicitamente con Delta2D.
El Project Manager le mostrará exactamente eso: un círculo amarillo significa que a las imágenes de ésta linea y ésta columna podrán aplicarseles un Warp directamente. Todas las demás combinaciones posibles podrán ser logradas mediante el uso de dos o más Warpings implicitos directos.

Los iconos de color amarillo indican también que para ésta pareja de imágenes de gel Ud. tendrá que invertir todavía más tiempo. Mediante la creación de Match vectores, Delta2D puede equilibrar én todo el proyecto de manera manual ó automática la diferencia de trayectoria para cada una de éstas parejas.

Cuando se utiliza 'Automatic' Warpings, Delta2D puede calcular también éste automáticamente. Escoja para eso 'Window' -> 'Job Manager' y presione el botón Comenzar 'Start'. Job Manager realizará y controlará las operaciones Warping.

Defina una Estrategia Warping para DIGE y otros Proyectos Multiples

Delta2D ofrece una estrategia Warping especial para DIGE y otros experimentos multiples con su estándar interno. Así pues, imágenes de gel de un mismo gel no tienen que ser corregidas, ya que entre éstas imágenes no hay ninguna diferencia en la trayectoria. Para Warpings entre geles utilizáremos las imágenes con el estándar interno. Èstas representan la misma mezcla de proteinas, y a razón de que poseén patrones idénticos, deberían poder aplicarseles un Warp fácilmente.

Antes de comenzar, asegurese de que la función 'Use Internal Standard' en 'Project Properties', ha sido ya activada, y que las imágenes de gel han sido correctamente definidas como imágenes estándar.

Abra en el menú del Project Manager 'Project' -> 'Warp Strategy' (ver próxima página) y escoja entonces 'In-Gel Standard Warping Strategy'.
El modo Warp entre las imágenes de un gel debería hacerse con la función ‘Identical’ y entre los geles con la función ‘Automatic’. Confirme con OK para poder aplicar la estra-tegia elegida.

El modo Warp 'Identical' significa que Delta2D utiliza las imágenes sin Warping. Esto afecta las 3 imágenes de gel para cada gel con Propiedades DIGE. Naturalmente Ud. puede cambiar tambien éstas propiedades (por ejemplo cuando se produce una pequeña deformación entre las imágenes durante el proceso de escaneo de las mismas).

Warp Manager: In-Gel Standard Warping Strategy

SmartVectors^TM: Encontrar Match Vectores Automáticamente

Utilize ésta tecnología para producir un Warping: En Project Manager Ud. verá seguida-mente para cada Warping directo un Icono Amarillo. El Warping en Delta2D se basa en los así llamados Match vectores, los cuales serán encontrados de manera rápida y segura.

En Project Manager Ud. verá una tabla general de todas las imágenes del proyecto. Para abrir una imagen de gel par como imagen de canal dual (‘Dual View’), posicione el indicador de su ratón sobre la línea de una imagen (por ejemplo ('control_01'), de manera tal que coincida con la columna de otra (por ejemplo 'control_02'). Presione ahora sobre el botón 'View' que aparecerá. Una nueva ventana ('Dual View') muestra la superposición de colores falsos de ambas imágenes (por ejemplo, 'control_01' en azul y 'control_02' en naranja). A travéz de éstas Ud. podrá ver inmediatamente las diferencias entre los patrones de los spots: spots en negro o gris tienen en ambas imágenes casi la misma intensidad, spots en naranja son más fuertes en control_2, spots en azul son allí más débiles. Entre más el color de los spots tiende hacia uno de los extremos, mayor será la diferencia de la expresión.

Imagen de Canal Dual Dos imágenes de gel

Cuando Ud. analize un proyecto DIGE, abra por favor Dual View de las imágenes estándar interno de diferentes geles para el Warping.

Naturalmene Ud. podrá ver completamente y en todo momento las diferentes regiones, ó las imágenes de canal dual, hacer un zoom hacia dentro ó hacia fuera, ó sencillamente ver cada imagen por separado, además puede cambiar la presentación de las imágenes con ‘Histogramas’ () del menú 'Images'. La regleta de ajustes la utilzará para adaptarla a los ajustes o propiedades. Con el botón ‘Equalize' () las imágenes se dejan balancear. Los cambios causan un efecto solamente en la presenta-ción, más no en la cuantificación, ya qué ésta solo se realiza con éxito en la imágen origi-nal. Por favor controle Ud. también a travéz del botón ‘Background’ () si el fondo de la imagen ha sido escondida. Èste ajuste ayuda a reconocer mucho mejor las diferentes posiciones de los spots.

Histograma: diálogo de ajustes

Después de verificar los ajustes o propiedades del histograma con OK, presione ahora sobre el botón 'Find Match vectores' en Dual View para que así la tecnología SmartVectors^TM de Delta2D pueda encontrar los vectores para el gel par actual. Una vez terminada la operación el modo Warp será cambiado a 'exact'.

Delta2D hace una diferencia entre vectores puestos manualmente y vectores encontrados automáticamente. A travéz de la confirmación de un Match vector que ha sido encontrado automáticamente (presionar la tecla derecha del ratón sobre el Vector y luego confirmar 'Approve') y éste vector será entonces declarado como puesto manualmente.

Haga ahora clic sobre el botón ‘Warp’ () y Delta2D adaptará las imágenes de acuerdo con el Match Map. En las resultantes del Warp Ud. podrá ver y captar rápidamente las diferencias en los niveles de expresión de los mismos spots cuando éstos han sido compensados completamente. Regiones con Warp imcompletas muestran una al lado de la otra, ó en parte el mismo spot patrón, sobrepuestos en naranja y azul. Por regla general Delta2D crea entonces solamente Match vectores, cuando las regiones correspondientes de los geles permiten éstos con suficiente calidad. Ud. puede en todo momento cambiar nuevamente las imágenes a su órigen primitivo, es decir sin Warp (botón ‘Unwarp’ ) para poder juzgar en original y poder corregirlos en caso de ser necesario.

Ud. puede usar el botón 'Find Match vectores' más de una vez. La tecnología SmartVectors^TM de Delta2D utilizará los vectores ya existentes como base para la detección de otros vectores, así aumentará la exactitud de los resultados:

Haga clic sobre el botón 'Find Match vectores'. Delta2D le preguntará, que se deberá hacer con los vectores anteriormente conseguidos automáticamente: Ud. puede utilizar éstos como fundamento para la segunda interacción con SmartVectors^TM ó descartarlos.

Tan pronto qué se haya confirmado como mínimo ún vector, para una imagen par, (puesta manualmente, ó conseguida automáticamente y confirmada manualmente), cambia el color del icono en el Project Manager de amarillo a verde, así Ud. sabrá qué ya ha trabajado en éste par. Ud. debería generalmente confirmar todos los vectores después de la finalización de un Warping: (menú: 'Matches' -> 'Select Non-Approved', luego 'Matches' -> 'Approve Selected').

Creación Manual, Borrado y Cambios de Match Vectores

Para poder trabajar con Match vectores, seleccione ‘Match Vector Tool’: Haga clic sobre el botón más alto del panel de herramientas vertical izquierdo de Dual View.

A veces es necesario corregir Match vectores que han sido conseguidos automáticamente. Recomendamos en éste caso trabajar con grandes regiones de imagen (no con spots únicos). En caso de que uno o más Vectores Match tengan que ser corregidos, borre sencillamente todos los vectores de ésta región (haga clic con la tecla derecha de su ratón luego 'Delete') y haga clic nuevamente en 'Find match vectors', y con SmartVectors^TM y poder encontrar entonces otros mejores. Vectores vecinos altamente cualitativos mejoran los resultados de la nueva interacción.

Dual View después del Warping

Naturalmente Ud. puede poner Match vectores de forma manual:

• Seleccione un único Match Vector
  Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den jeweiligen Vektor - selektierte Vektoren werden hervorgehoben.
• Seleccione varios Match Vectores en una Región
  Arrastre con la tecla izquierda presionada de su ratón un rectángulo alrededor de los vectores a seleccionar.
• Borrado de Match Vectores
  Para poder borrar un vector, marque éste con la tecla derecha de su ratón y escoja 'Delete' ó presione sencillamente la tecla ‘borrar’ de su teclado. Ud. puede seleccionar varios vectores y borrarlos de ésta manera.
• Poner Nuevos Match Vectores
  Haga clic sobre el spot en la imágen naranja y luego a su respectiva imágen en azul. Los spots están ahora unidos a travéz de un vector, los cuales podrán ser finalmente extraídos uno tras otro haciendo clic sobre el botón ‘Warp’.
• Cambiar Match Vectores
  Hale Ud. ahora solo una parte final del vector, para poder cambiar la posición de éste (por ejemplo asignar a otro spot, optimizar destino del spot, etc.).

Las operaciones de Match vectores pueden ser retrocedidas a travéz de 'Edit' -> 'Undo' ().

Haga clic sobre el botón ‘Warp’, para poder ver el efecto de los nuevos vectores, Ud. puede adiccionar, corregir ó borrar Match vectores interactívamente, hasta que Ud. esté completamente satisfecho con los resultados.

Verificar Resultados

De allí qué, el análisis completo depende de la calidad del Warping, debería Ud. prestar mucha atención en el siguiente paso. Para poder asegurar una calidad suficiente, reco-mendamos controlar de manera crítica los siguientes puntos:

• En el Project Manager Ud. debería ver solámente celdas con iconos verdes, ó sin ellos.
• Abra Dual View para cada imagen de gel par con Warp directo (cada celda con un icono verde en Project Manager) y asegure una completa igualdad de covertura en el patrón de los spots para cada imagen Warp de canal dual. Invierta cortamente ‘Exact’ en modo ‘Global’ Warp, de ésta manera es posible recononocer rápidamente vectores extraños ó con errores.

Continue cuando esté satisfecho con los resultados, y no sean más necesarias ningún tipo de correcturas.

Los datos que sirven de ejemplo también contienen mapas match (Match Maps) ya listos. Para tener una idea de si Ud. ha hecho todo correctamente Ud. podrá importar éstos para las correspondientes imágenes pares, escoja en menú 'Matches' luego 'Import'. En caso de que un match vector azul, su parte final señala hacia la parte final de un spot color naranja, ó al revés, tienen entonces dichos vectores una tendencia falsa. Escoja en éste caso 'Mat-ches -> 'Invert'.