2.35 MB

Setup Gel Image Warping

Hintergrund: Warum ist Warping für die Auswertung von 2D Gelbildern so wichtig?

In der Praxis treten Spots des gleichen Proteins auf verschiedenen Gelen nie exakt an gleicher Position auf. Diese Laufunterschiede sind die Ursache für die Ineffizienz 'traditioneller' 2D-Gelbildauswertungspakete, die echtes Warping nicht beherrschen.

Gelbild mit Gitter	Das gleiche Gelbild nach dem Warping

Wenn Sie bereits 'traditionelle' 2D-Gelauswertungssoftware kennenlernen durften, haben Sie wahrscheinlich auch schon die 'automatisch' gefundenen Matchings auf Basis der Spotumrisse in langwieriger und ermüdender Kleinarbeit korrigieren müssen.
Mit einer Bildverarbeitungsmethode namens Warping gleicht Delta2D Laufunterschiede zwischen 2D-Gelbildern schon vor Spotdetektion und quantitativer Analyse aus: Das Ergebnis sind scheinbar perfekte Gele, auf denen gleiche Spots immer an gleichen Positionen auftreten.
DECODON führte im Jahr 2000 mit Delta2D 1.0 das Warping für die Auswertung von 2D Gelbildern ein.

DIGE und andere Multiplex Techniken ermöglichen es, mehrere Proben auf einem Gel zu trennen. Dadurch wird das Problem unterschiedlicher Spotpositionen etwas gemildert. Zwischen den verschiedenen Gelen treten jedoch immer noch Laufunterschiede auf.

Im Folgenden sehen Sie zwei Gelbilder in zwei Farbkanälen auf einem Dual Channel Bild: Ein Gelbild wurde durch Delta2D orange, das andere blau eingefärbt. Ohne Warping (links) fällt es relativ schwer, gleiche Spots zu finden.

Zwei noch ungewarpte Gelbilder in einem Dual Channel Bild.	Zwei gewarpte Gelbilder auf einem Dual Channel Bild. Unterschiede in der Expression sind klar sichtbar. Durch das Warping kann Delta2D gleiche Bildpositionen über ein ganzes Projekt einander zuordnen. Dies ermöglicht beispielsweise 100%iges Spot Matching und Bildfusion.

Die gewarpten Bilder in der Dual Channel Ansicht erlauben eine qualitative Analyse der Spotmuster: Blaue Spots sind stärker auf Gel A, orange stärker auf Gel B exprimiert. Dunkle Farben deuten auf Spots gleicher oder ähnlicher Intensität hin.
Neben der Erzeugung von Dual Channel Bildern basieren noch weitere Schlüsseltechnologien von Delta2D auf der Warping-Korrektur von Gelbildern. Dazu gehören:

• 100%iges Spotmatching
  Sie erreichen eine weit höhere statistische Verlässlichkeit bei der Auswertung von Expressionsprofilen.
• Bildfusion
  Sie erreichen eine weit höhere statistische Verlässlichkeit bei der Auswertung von Expressionsprofilen.
• Proteomkarten
  Sie katalogisieren ihre Proteinidentifikationen als Annotationen.
• Color Coding
  Um Spots mit ähnlichen Expressionsprofilen zu erkennen, können Sie das 'Color Coding', welches auf Bildfusion und 100% Spot Matching aufbaut, verwenden.

Definieren einer Warping Strategy

Sie brauchen nicht für jede mögliche Kombination von Gelbildern ein Warping zu ermitteln: Das Warping für ein ganzes Projekt mit n Gelen basiert auf exakt n-1 paarweisen Warpings: Gibt es ein Warping zwischen Gel A und Gel B sowie eines zwischen Gel B und C, dann kann Delta2D - 'implizit' - ein Warping zwischen A und C erzeugen.

Implizites Warping

Eine Warping Strategie beschreibt, welche paarweisen direkten Warpings Delta2D verwenden wird, um das gesamte Warping (d. h. jede mögliche Kombination von Gelbildern) für Ihr Projekt zu berechnen.
Für unser Beispielprojekt verwenden Sie bitte die 'Group Warping' Strategie: Diese Strategie verbindet jeweils beide Gelbilder der Replikatgruppen mit dem 'Automatic' Warp Mode. Um die drei Replikatgruppen zu verknüpfen, werden die jeweils ersten Bilder der zweiten und dritten Gruppe ('1min' und '10min' Gruppe) mit dem ersten Bild der 'control' Gruppe (control_01) durch 'Automatic' Warp verbunden.

Wechseln Sie dazu in den zweiten Schritt im Workflow 'Setup Gel Image Warping' und klicken Sie auf den Link 'Warp Strategy'. Der Delta2D Warping Strategy Manager öffnet sich. Wählen Sie die 'Group Warping Strategy' aus. Der 'Automatic' Warp Mode ist für die Warpings innerhalb sowie zwischen den Gruppen voreingestellt. Bestätigen Sie mit 'OK', um die gewählten Einstellungen auf das Projekt anzuwenden.
Die Group Warping Strategy empfiehlt sich für die meisten Projekte mit Replikatgruppen. 'Verwandte' Gele, wie eben Replikate, sollten aufgrund ihrer hohen Ähnlichkeit immer direkt und wenn möglich automatisch gewarpt werden. Im Manual finden Sie unter 'Defining a Warp Strategy for the Complete Project' weitere Informationen.

Warping Strategy Manager

Sie können auch eine individuelle Warping Strategie im 'Warping Setup' (im 'Window' Menü) erstellen, indem Sie zu verbindende Bilder einfach übereinander ziehen. Allerdings ist das Erstellen einer Strategie mit dem 'Warping Strategy Manager' wesentlich einfacher und schneller.

Der zugewiesene 'Automatic' Warp Mode nutzt die Delta2D SmartVectorsTM Technologie. Diese liefert Match-Vektoren, die korrespondierende Spots automatisch finden und miteinander verbinden. Überprüfen Sie bitte immer die Qualität des 'Automatic' Warp Mode für die entsprechenden Dual Channel Bilder. Falls nötig verbessern Sie das Warping wie unten beschrieben.

Der Warping Strategy Manager überschreibt vorherige manuelle Einstellungen für das Warping. Bestehende Match-Vektoren werden nicht verändert - aber ggf. nicht mehr verwendet. Um Irritationen zu vermeiden sollten Sie den Warping Strategy Manager direkt nach dem Organisieren eines neuen Projektes und später möglichst nicht mehr benutzen.

Öffnen Sie nun das 'Warping Setup' Fenster, in dem Sie auf den Link 'Setup direct warpings' (alternativ: 'Window' -> 'Warping Setup') im zweiten Workflow-Schritt klicken. Sie sollten nun sehen, dass die Warping Strategie angewendet wurden, so dass alle Bilder miteinander verbunden sind:

Definieren einer Warping Strategie. Die 'Warping Setup' Komponente nach dem Auswählen der 'Group Warping Strategy' (Grid Layout).

Die Warping Strategie verbindet also Bilder innerhalb der Gruppen sowie zwischen den Gruppen hier mit dem 'Automatic' Warp Mode. Alle verbleibenden Gelbilder werden von Delta2D selbständig 'implicit' verbunden.

Das Warping Setup Fenster zeigt Ihnen genau dies an: Ein gelbe Linie mit einem gelben Icon bedeutet, dass die Bilder gewarpt werden. Das Zahnrad symbolisiert den automatischen Warp-Mode. Alle anderen möglichen Kombinationen von Bildern werden durch Nutzung zweier oder mehrerer direkter Warpings implizit erreicht. Gelbe Icons deuten aber auch darauf hin, dass für diese Gelbild-Paare von Ihnen noch Zeit investiert werden muss. Durch das Erzeugen von Match-Vektoren für jedes dieser Paare - automatisch und/oder manuell - kann Delta2D alle Laufunterschiede im gesamten Projekt ausgleichen.

Eine Warping Strategie für DIGE
und andere Multiplex-Projekte definieren

Delta2D bietet eine spezielle Warping Strategie für DIGE und andere Multiplex Experimente mit Internen Standards an. Gelbilder vom gleichen Gel müssen nicht korrigiert werden, da es zwischen diesen Bildern keine Laufunterschiede gibt. Für Warpings zwischen den Gelen verwenden wir die Bilder mit dem Internen Standard. Dieser repräsentiert immer das gleiche Proteingemisch und sollte aufgrund des identischen Musters einfach gewarpt werden können.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie bitte sicher, dass Sie 'Use Internal Standard' in den 'Project Properties' aktiviert und die richtigen Gelbilder als Standard-Bilder definiert haben.

Klicken Sie auf den Link 'Warp Strategy...' im zweiten Schritt ('Setup Gel Image Warping') des 'Workflow', um den 'Warping Strategy Manager' zu öffnen. Wählen Sie die 'In-Gel Standard Warping Strategy' aus.
Der Warp Mode zwischen Bildern eines Gels sollte 'Identical', derjenige zwischen den Gelen 'Automatic' sein. Bestätigen Sie mit OK, um die gewählte Strategie anzuwenden.

Warp Manager: In-Gel Standard Warping Strategy

Der Warp Mode 'Identical' bedeutet, dass Delta2D die Bilder ohne Warping verwendet. Dies trifft für die drei Gelbilder pro Gel im DIGE Setup zu. Natürlich können Sie diese Einstellung auch ändern (z.B. wenn es eine kleine Verschiebung zwischen den Bildern während des Scannens gab).